19. Методы выделения чистых культур микробов

Чистая культура – это микроорганизмы одного вида, выросшие на питательной среде. Выделение чистой культуры является важным этапом бактериологического исследования. Чистая культура необходима для изучения морфологических, культуральных, биохимических и антигенных свойств, по их совокупности устанавливается видовая принадлежность микроорганизма.

Микробная колония – это потомство или популяция одной микробной клетки при росте на плотных питательных средах.

1. Методы механического разделения микробов

Метод Дригальского. Берут 3-4 чашки Петри со стерильным агаром, на поверхность первой наносят каплю смеси бактерий, которую стерильным шпателем растирают по поверхности агара, закрывают крышкой. Этим же шпателем растирают по поверхности второй чашки, затем третьей и четвертой. Чашки помещают в термостат, перевернув вверх, чтобы конденсат не смыл колонии. Колонии изучают по внешнему виду, готовят бактериологический препарат, окрашивают и микроскопируют

Метод Пастера основан на последовательном разведении в 10 пробирках с жидкой средой капли смеси бактерий, с расчетом получить в последней пробирке чистую культуру. Кох, применил метод Пастера на плотных расплавленных средах и содержимое пробирки выливал в отдельную чашку Петри. Выдерживают в термостате. Пересевают отдельную колонию в среду с пробирками и получают чистую культуру.

2.Методы использования биологических особенностей микроорганизмов

Использование химических веществ, антибиотиков, добавленных к питательным средам для подавления роста некоторых микробов. При выделении спорообразующих микроорганизмов исследуемый материал прогревают при 80С – 20 мин, при этом вегетативные формы погибают, а споры прорастают. Затем выделяют культуру по Дригальскому. Химический метод основан на устойчивости микобактерий к действию растворов щелочей и кислот 6-18 % раствор серной кислоты в течение 30 мин, затем отмывают стерильным физраствором путем центрифугирования. Осадок высевают на специальную среду, содержащую бактериостатическую краску, которая задерживает рост посторонней микрофлоры и не препятствует росту микобактерий.

Метод биологической пробы – вводят лабораторному животному исследуемый материал, через несколько дней оно погибает и бактериологической петлей с внутренних органов делают посев на питательные среды. Проводят при очень загрязненном посторонней микрофлорой патматериале. Для выделения подвижных культур каплю исследуемого материала помещают на дно пробирки со скошенным агаром в конденсационную жидкость. При наличии в материале подвижных бактерий через 8-12 часов на поверхности агара отмечается рост бактерий. Пересев делают с самой верхней части агара. Для выделения анаэробов посевы осуществляют в пробирках и чашках Петри, помещенных в эксикатор или анаэростат.

19. Изучение культуральных свойств микроорганизмов

В процессе иденти­фикации наряду с другими свойствами у микроорганизмов изу­чают культуральные признаки — особенности роста на плотных, жидких и полужидких питательных средах при определенных ус­ловиях.

На плотных средах изучают колонии микроорганизмов. Бакте­рии каждого вида формируют колонии с определенными призна­ками, которые обычно учитывают при идентификации. Раз­мер колоний: крупные — диаметром 4...6 мм и более, сред­ние—2...4 мм, мелкие — 1...2мм и точечные колонии диаметром менее 1 мм. Форма колоний может быть правильной круг­лой, неправильной (амебовидной, розеткообразной), корневид­ной (рис. 42). Цвет зависит от способности микроорганизма образовывать пигмент: белый, желтый, красный, сине-зеленый и т. д. Бактерии, не синтезирующие пигмент, формируют бесцвет­ные колонии. Учитывают характер поверхности, ко­торая может быть шероховатой, блестящей, матовой, сухой, влажной, гладкой, радиально или концентрически исчерченной. Края колонии могут быть ровными, волнистыми, зазубренны­ми, бахромчатыми, их исследуют невооруженным глазом и под малым увеличением микроскопа (рис. 43). Рельеф (про­филь) определяют, рассматривая колонию сбоку; различают плоские, конусообразные, куполообразные, плоские с конусо­видным центром или углублением в центре колонии, с утолщен­ными (валикообразными) краями (рис. 44). Учитывают про­зрачность колонии: непрозрачная, полупрозрачная, про­зрачная. Структура может быть однородной, зернистой, волокнистой и т.д. (рис. 45). Ее выявляют при слабом увеличе­нии микроскопа. Консистенция может быть пастообраз­ной, слизистой, плотной (сухой) и т.д.; ее определяют, дотраги­ваясь до колонии бактериологической петлей. Колонии некото­рых видов врастают в толщу питательной среды, что также определяют при помощи бактериологической петли. Запах: многие виды бактерий в процессе роста на питательных средах выделяют специфические ароматические вещества.

Ценную дополнительную информацию об особенностях стро­ения колоний дает их изучение в косопадающем пучке света (рис. 46). Культуры на прозрачной агаровой среде в чашках Пет­ри помещают на предметный столик бинокулярной лупы. Между бинокулярной лупой и источником света помещают зеркало от микроскопа вогнутой стороной вверх таким образом, чтобы лучи, отраженные от него, попадали в плоскость изучаемого объекта под углом 40...45°. Зеркало устанавливают на равном удалении от объекта и источника света (12...14 см). При таком осве­щении колонии бактерий могут быть окрашены в различные цве­та. Цвет зависит как от видовых особенностей, так и от состоя­ния культуры (S-, R-формы, см. тему 12).

В жидких средах учитывают следующие признаки: степень помутнения среды (интенсивное, среднее, слабое), на­личие или отсутствие пристеночного кольца на гра­нице мениска и внутренней поверхности пробирки, харак­тер поверхностной пленки (толщина, цвет, поверхность), характер осадка (обильный, скудный, ком­пактный, хлопьевидный, слизистый). При характеристике осадка пробирку слегка встряхивают и учитывают результат: осадок раз­бивается в гомогенную равномерную суспензию; образуются мелкие или крупные хлопья, глыбки; слизистый осадок при встряхивании обычно поднимается в виде косички. Пигментообразующие микроорганизмы вызывают окрашивание питательной среды и осадка (желтое, зеленоватое, красное и т. д.).