Окраска по Циль-Нильсену

В природе существует группа микроорганизмов, устойчивых к действию ки- слот, щелочей и спиртов; они относятся к роду Mycobacterium. Среди них встре- чаются непатогенные(обитающая в сене и впервые обнаруженная в траве–тимо- феевке палочка Тимофеевой травы и др.), которые обнаруживают в молоке, масле, кормах, сперме, содержимом кишечника. К патогенным микобактериям относят возбудителей туберкулеза человека и животных (Mycobacteriumtuberculosis), воз- будителя лепры (Mycobacteriumleprae) и т.д.

Кислотоустойчивость объясняется особым химическим составом микробных клеток, в частности, высоким содержанием жировоскоподобных веществ и нали- чием миколовой кислоты. Эти микробы с трудом воспринимают красящие раство- ры. Поэтому применяют красители протравители и нагреванием мазка над пламе- нем. Окрасившись, они прочно удерживают первую краску и не обесцвечиваются при кратковременном воздействии кислоты или спирта.

Метод окраски по Циль-Нильсену:

1. на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и нано- сят карболовый фуксин Циля и нагревают до появления паров 2-3 мин.

2. бумагу удаляют пинцетом и на 5 секунд наносят на мазок 5 % раствор сер- ной кислоты.

3. тщательно промывают водой и докрашивают метиленовым синим 2-3 мин.

4. мазок промывают водой, высу- шивают и смотрят под иммерсией.

Микобактерии окрашиваются в красный цвет, фон (клетки ткани и неки- слотоустойчивые бактерии) – синий. При воздействии на мазок серной кислоты некислотоустойчивые бактерии легко

Рисунок 19 - Окрашивание кислото- устойчивых микробактерий в крас- ный цвет.

обесцвечиваются и воспринимают вторую окраску метиленовым синим (рисунок

19).

Контрольные вопросы:

1. Простые и сложные методы окраски.

2. Описать технику метода окрашивания по Граму.

3. В чем сущность окраски по Циль-Нильсену.

4. Особенность строения клеточной стенки грамположительных и грамотри- цательных бактерий.

5. Описать основные формы бактерий.

Тема 1.3. Окраска спор, капсул бактерий, методы определения подвижно- сти бактерий.

Цель занятия: изучить окраску спор и капсул микроорганизмов, изучить под- вижность микроорганизмов, уяснить правила приготовления мазка для обнаруже- ния капсулы и методы окраски капсул, уяснить методы окраски спор, уяснить ме- тоды для определения подвижности микроорганизмов.

Содержание:

1. Окраска спор, капсул бактерий.

2. Методы определения подвижности бактерий.

Бактериальная спора, эндоспора, (от лат.

Spora - семя, посев) – непостоянный структурный элемент бактериальной клетки, защищающая ее от неблагоприятных воздействий внешней среды (ри- сунок 20). Споры представляют собой покоящиеся формы прокариот, выдерживающие влияние высо-

кой температуры,ультрафиолетовое облучение, радиации, вакуума, высушивание, действие хими-

Рисунок 20 - Бактериальная спора.

ческих дезинфектантов, растворителей, различного рода токсических веществ и других неблагоприятных факторов, приводящих к гибели вегетативные клетки. В

природе образование спор помогает клеткам избегать гибели при истощении суб- страта или высушивании, воздействии радиации или химических веществ. Неко- торые эндоспоры остаются жизнеспособными в течение 500 лет (например, споры бацилл сибирской язвы в скотомогильниках),споры актиномицетов —до7 500 лет, но совершенно уникальным является случай проращивания спор Bacilluscereus, обнаруженных в кишечнике пчелы, найденной в кусочке янтаря, насчитывающего 25 — 30 млн. лет!

Бактериальные споры (эндоспоры) формируются внутри материнскихвегета- тивных клеток бактерий в цитоплазме. Спорообразующие бактериипринадлежат к родам Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Desulfotomaculum, Sporosarcina, Thermoactinomyces.Все эти микроорганизмы образуют толстую клеточную стенку грамположительного типа, что, по-видимому, является необходимым для спо- рообразования.

Как правило, в одной бактериальной клетке образуется одна спора, однако известны случаи формирования до пяти спор в одной бактериальной клетке.

Споры могут иметь следующее расположение (рисунок 21):

1. центральное (Bacillus anthracis)

– в центре клетки;

2. терминальное (Clostridium tetani) – на одном из полюсов клетки;

3. субтерминальное (Clostridium chauvoei) - ближе к одному из полюсов клетки.

Процесс спорообразования назы- вается споруляция.

Под воздействием неблагоприят-

ных факторов внешней среды в месте образования спор (при споруляции)

Рисунок 21 - Расположение спор у бактерий.

клетка теряет значительное количество свободной воды, протоплазма уплотняется и покрывается плотной оболочкой, пропитанной смолистыми и липоидными ве- ществами.

Строение зрелой споры сложное и однотипное у разных видов бактерий. Центральная ее часть представлена сердцевиной, или спороплазмой, содержащей нуклеоид, рибосомы и нечетко выраженные мембраны структуры. Спороплазма окружена цитоплазматической мембраной, к которой прилегает зачаточный пеп- тидогликановый слой, затем специфическим для спор массивным слоем кортек- са,или коры. На поверхности кортекса имеется внешняя мембрана. Снаружи спо- ра окружена многослойной оболочкой. У многих бактерий по окружности наруж- ного слоя споровой оболочки располагается экзоспорум.

Бактериальные споры обладают высокой устойчивостью к факторам внеш- ней среды благодаря следующим свойствам:

1. у зрелых спор обмен веществ находится на крайне низком уровне, так как отсутствует свободная вода (вода находится в связанном состоянии);

2. высокая концентрация магния и кальция увеличивает устойчивость спор к нагреванию;

3. малая ферментативная активностью спор;

4. наличие многослойных оболочек, из которых наружная экзина –защищает спору от факторов внешней среды из-за плохой проницаемости, внутренняя – ин- тина – способствует прорастанию споры (переход в вегетативную форму) при по- падании в благоприятные условия.

Если диаметр споры меньше толщины микробной клетки, такие бактерии на- зывают - бациллы (Bacillusanthracis). Если диаметр споры больше толщины мик- робной клетки – клостридии(Clostridiumtetani). Данные спорообразующие бакте- рии представлены на рисунке 22.

Рисунок 22 - Спорообразующие бактерии.

Споры образуются в средах с нейтральной или слабощелочной реакцией при дефиците белковых веществ. Установлено, что этот процесс происходит намного быстрее в присутствии кислорода воздуха. Споры не образуются в средах, богатых белковыми веществами, например, в крови и сыворотке крови, живом организме и невскрытом трупе. При нарушении целостности трупа возможно спорообразова- ние. Образование спор зависит от температуры среды.

Например, процесс спорообразования возбудителя сибирской язвы при тем- пературе 30 – 37^о С заканчивается через 1-2 часа, при 24 ^оС – через 16 часов, при 18 ^оС – затягивается до 70 часов. Ниже 15 ^оС и выше 42 ^оС у возбудителя сибирской язвы процесс спорообразования не происходит. А после попадания в благоприят- ные условия споры начинают прорастать уже через 5-10 минут.

Прорастание спящей споры в активную вегетативную клетку — не менее сложный процесс, чем спорообразование. Оно проходит в три стадии:

• активация;

• созревание;

• прорастание.

При прорастании споры (от 1 до нескольких часов, в среднем спора образует- ся за 4-8 часов) оболочка постепенно набухает, мутнеет, увеличивается в размерах

и разрывается. Как правило, она разрывается в одном месте, в центре или по по- люсам, из места разрыва выходит бактерийный отросток, который затем развива- ется в бактериальную клетку.

В ветеринарной микробиологии выявление спор используют в качестве диф- ференциального морфологического признака.

Для окрашивания спор используют специальные, сложные методы окраски, где используются контрастные краски.

Рассмотрим два метода окраски по Пешкову иВиртцу.