РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

2. Идентификация, сравнение и поиск гомологичных белков, количественная оценка сходства белковых последовательностей.

Инструменты поиска гомологии могут принимать в качестве входных данных отдельную последовательность белка или использовать статистические модели, созданные на основе множественного выравнивания последовательностей известных родственных последовательностей.

Затем входные последовательности сравнивают с базой данных последовательностей от родственных особей или других видов. Затем полученные выравнивания оцениваются на основе числа совпадающих аминокислот или оснований и числа пробелов или делеций, созданных при выравнивании. Затем можно сделать вывод о сохранении последовательности путем обнаружения очень похожих гомологов в широком филогенетическом диапазоне.

BLAST (англ. Basic Local Alignment Search Tool — средство поиска основного локального выравнивания) — семейство компьютерных программ, служащих для поиска гомологов белков или нуклеиновых кислот, для которых известна первичная структура (последовательность) или её фрагмент. Используя BLAST, исследователь может сравнить имеющуюся у него последовательность с последовательностями из базы данных и найти последовательности предполагаемых гомологов. FASTA

Построение выравнивания аминокислотных последовательностей.

Парное выравнивание – используется для нахождения сходных участков двух последовательностей.

Множественное выравнивание – используется для сравнения 3 и более последовательностей. Может быть полезно для выявления консервативных остатков во всём семействе или отдельных подсемействах белков. Множественное выравнивание и профили последовательностей позволяют идентифицировать более слабые гомологии, чем «обыкновенное» парное выравнивание. Выравнивание проводят с помощью сервера CLUSTALW (или его аналогов).

Для чего то и другое:

1)сравнивая попарно белки разных организмов, мы можем сказать, какие организмы более похожи друг на друга, а какие — менее;

2)сравнивая одновременно десяток-другой белков, мы можем найти структурно- и функционально-важные участки (они обычно идентичны у родственных организмов), что бывает полезно при создании искусственных белков (дизайн лекарств).

Чем большее число на пересечении совпавших букв — тем больше количественный показатель сходства.

Для количественной оценки сходства последовательностей используют выравнивание

– расположение последовательностей одна под другой с сохранением порядка символов таким образом, чтобы достичь совпадения или сходства мономеров в наибольшем числе позиций. Выравнивание производится путем смещения частей последовательностей относительно друг друга и добавления разрывов в последовательности.

Количественный показатель сходства биологических последовательностей – score, или счет выравнивания – вычисляется путем сложения чисел из матрицы замен для каждой позиции. Score – это мера сходства, т.е. чем он выше, тем более сходны последовательности.

Если выравнивание содержит разрывы, они также должны быть учтены. Очевидно, что разрывы – это признак различия в молекулах, поэтому наличие разрывов должно понижать счет выравнивания. Величина, отнимаемая от счета выравнивания для учета разрывов, называется штрафом за делецию (штрафом за разрыв) – gap penalty.

Билет 17.

1.Вариабельность генома. Типы вариабельности последовательности ДНК. Усредненный геном вида.

Геном — совокупность наследственного материала, заключённого в клетке организма.

Последовательность ДНК двух неродственных людей отличается примерно на 0,2%. Именно эти, кажущиеся ничтожными, различия и определяют всю гамму характеристик, по которым один человек отличается от другого.

Вариации последовательности ДНК в геноме довольно условно принято делить на

мутации и полиморфизм.

Мутация – случайно возникшие, стойкие изменения генетического материала, происходящие спонтанно или под влиянием каких-либо факторов. Спонтанный мутационный процесс – важный источник появления новых аллелей, приводящий к увеличению генетического разнообразия популяций.

Мутационная теория. Основные положения:

•Мутация является скачкообразным стойким качественным изменением.

•Мутации разнонаправленные (полезные и вредные) и могут повторяться.

•Выявляемость мутаций зависит от выборки изучаемых организмов.

Классификация мутаций:

1.По характеру изменения генотипа: генные (точечные), хромосомные перестройки – изменение структуры хромосом, изменения числа наборов хромосом (пример – полиплоидия).

2.По характеру изменения фенотипа: Летальные. Морфологические. Физиологические, Биохимические, Поведенческие

3.По проявлению в гетерозиготе: Доминантные. Рецессивные.

4.По условиям возникновения: Спонтанные (возникающие без видимых причин)., Индуцированные (в результате воздействия).

5.По локализации в клетке: Ядерные. Цитоплазматические (мутации внеядерных генов).

6.По возможности наследования: Генеративные, т.е. в половых клетках. Соматические, наследуются в случае вегетативного размножения (пример - злокачественные опухоли).

Хромосомные перестройки:

•Инверсии – поворот отдельных участков на 180°. Парацентрическая – точки разрыва по одну сторону центромеры, перицентрическая – по разные. У гетерозиготных по инверсии особей в хромосомах образуется петля. У

гетерозигот по инверсиям происходит «запирание» кроссинговера (часть фрагментов делетируется)

•Делеции – утрата участка хромосомы. Гетерозиготные делеции цитологически выявляются из-за наличия петли в нормальном гомологе. Очень удобны для картирования генов. Не могут быть большими.

•Транслокации – перенос участка хромосомы в другое место. Реципрокные и инсерционные. Реципрокные транслокации возникают в том случае, если два фрагмента из двух разных хромосом отрываются и меняются местами. Инсерционная — хромосомная перестройка, при которой сегмент одной хромосомы встраивается внутрь другой хромосомы.

•Дупликации – удвоение участка хромосомы. Также возможно выявление цитологически изза наличия петли в мутантном гомологе.

Полиморфизм – это наличие нескольких вариантов генетического локуса в популяции. Дикий тип – аллель, который наиболее распространён в свободноживущей популяции, то есть обладает наибольшей частотой встречаемости.

Наиболее редкий из вариантов имеет частоту встречаемости, превышающую частоту обратного мутирования. На практике, признак или маркер считают полиморфным, если наиболее редкий вариант встречается чаще, чем в 1% наблюдений.

Вариант полиморфизмов генома используются как молекулярно-биологические маркеры – полиморфный признак, выявляемый на уровне ДНК для определённого гена или другого участка хромосомы при сравнении различных особей, сортов, видов.

90% всех вариантов ДНК-полиморфизмов: с различным воздействием на фенотип.

Типы полиморфизма генома:

1.SNPs (однонуклеотидный полиморфизм) – отличия последовательности ДНК размером в 1 нуклеотид в геноме другой представителей одного вида или между гомологичными участками гомологичных хромосом.

Наиболее часты такие точечные замеы в интронах, а в кодирующей части встречаются реже. Если точечная мутация приходится на сайт узнавания рестриктазой, то ее можно выявить по различию в длине рестрикционных фрагментов. Эти вариации генома, как правило, диаллельны, т.е. встречается 2 варианта.

Однонуклеотидный полиморфизм встречается в пределах кодирующих последовательностей генов, в некодирующих участках или в участках между генами. SNPs, встречающиеся в кодирующих участках, могут не менять аминокислотную последовательность белка из-за вырожденности генетического кода (одна и та же информация может быть записана различными триплетами).

Однонуклеотидные полиморфизмы кодирующих участков бывают двух типов:

•Синонимические – оставляют аминокислотную последовательность белка без изменения

•Несинонимические – изменяют аминокислотную последовательность

Однонуклеотидный полиморфизм, встречающийся в некодирующих участках гена, возможно, влияет на генетический сплайсинг, деградацию мРНК, связывание транскрипционных факторов, регуляторы малых интерферирующих РНК, инициацию

итерминацию трансляции.

2.Инсерции-делеции (инделы) – размер чаще всего 2-100 нк, сотни тысяч в геноме человека:

•Простые инделы – 2 аллеля с наличием-отсутствием.

•Мультиаллельные с переменным кол-вом числа сегментов, разделяются на:

oМикросателлиты – повторы нуклеотидных блоков ~2-10 нпо до десятков раз – короткие тандемные повторы (STRP) (Short tandem repeat polymorphisms)

Детекция размера – ПЦР. STRP маркеры могут быть использованы для панели типирования человека

oМинисателлиты – повторы 10-100 нк, VNTR (variable number tandem repeat polimorphism) различаются количеством тандемных копий.

oПолиморфизм числа копий 200-2 млн – полиморфизм по наличию или отсутствию мобильных генетических элементов (таких как Alu-повторы, ретротранспозоны семейства LINE, псевдогены)

Еще один вид вариабельности генома – мобильные генетические элементы.

1.Транспозоны с генами транспозиции (cut and paste) Транспозазой и Резольвазой. Редкие у человека, например, mariner. 2-3 %

2.Ретротранспозоны – транспозиция через обратную транскрипцию, в геноме. Большая часть в геноме, ~42%.

• без LTR - короткие неавтономные SINE и длинные LINE

o SINE -(Short Interspersed Nuclear Elements) - 80-500 bp, tRNA-

производные), например, Alu (350 bp) у чел-ка >1 млн, ~5-15% у млекопит.)

oLINE-(Long Interspersed Nuclear Elements, ~6 kb, например, у человека около 500 000 ~ 21% )

•LTR-содержащие (~100 bp - 5 kb) – отличатся от эндогенных ретровирусов и их остатков отсутствием гена env. Например, HERV, Ty1/copia и Ty3/gypsy у дрозофилы. Границы между RT и ретровирусами (~8%) размыты. Изменяют активность генов, обеспечивают эволюцию геномов

Следовательно, под геномом организма понимают суммарную ДНК гаплоидного набора хромосом и каждого из внехромосомных генетических элементов, содержащуюся в отдельной клетке зародышевой линии многоклеточного организма.

В определении генома отдельного биологического вида необходимо учитывать, вопервых, генетические различия, связанные с полом организма, поскольку мужские и женские половые хромосомы различаются. Во-вторых, из-за громадного числа аллельных вариантов генов и сопутствующих последовательностей, которые присутствуют в генофонде больших популяций, можно говорить лишь о некоем усреднённом геноме, который сам по себе может обладать существенными отличиями от геномов отдельных особей. Размеры геномов организмов разных видов значительно отличаются друг от друга, и при этом часто не наблюдается корреляции между уровнем эволюционной сложности биологического вида и размером его генома.

Геном: 1. Хромосомная ДНК. 2. Внехромосомная ДНК: плазмиды, эписомы, для эукариот еще и михондриальная и хлоропластная ДНК. Хлоропластный и митохондриальный геномы. 3. Подвижные генетические элементы: инсерционные элементы, транспозоны, мобильные диспергированные гены, вирусы.

2. Взаимодействие биомолекул в клетке. Белковые сети и метаболические пути. Метаболом.

Биомолекулы — это органические вещества, которые синтезируются живыми организмами. В состав биомолекул включают белки, полисахариды, нуклеиновые кислоты, а также более мелкие компоненты обмена веществ.

Структурная иерархия всех классов биомолекул: макромолекулы образуются из мономерных звеньев определенного строения с помощью разных химических связей.

•Водородная связь — форма ассоциации между электроотрицательным атомом и атомом водорода H, связанным ковалентно с другим электроотрицательным атомом.

•Ионная связь – это связь,образующаяся между катионами и анионами за счет их электростатического напряжения.

•Вандерваальсовы взаимодействия – самые низкоэнергетические (около 0,5

кДж/мол), однако в них принимают участие все атомы без исключения, поэтому суммарный вклад этих взаимодействий значителен, и пренебрегать им нельзя. Они возникают между молекулами или атомами, являющимися постоянными диполями. Величина этого взаимодействия невелика и сильно зависит от расстояния между взаимодействующими частицами.

Например, образование слабых связей между ферментом и субстратом понижает энергию активации и запускает ферментативную реакцию (сюда же: гормон-рецептор, антиген-антитело).

Белок состоит из аминокислот, которые могут иметь положительные или отрицательные заряды и с той или другой эффективностью взаимодействовать или,

наоборот, не взаимодействовать с водой. Почти всегда в клетке найдется другая молекула, которая обладает комплементарным рисунком положительных и отрицательных зарядов (или гидрофильных и гидрофобных связей). И две такие молекулы могут связаться друг с другом, как инь и ян. И чем форма сложнее, тем больше взаимодействий осуществляется на поверхности, соединяющей две молекулы, и тем более крепким будет конечный комплекс. При этом такое связывание вовсе не означает, что молекулы А и Б всегда будут вместе. Они могут находиться какое-то время раздельно, иногда они будут стукаться и находить друг друга. В результате такого взаимодействия обе структуры изменяются. Они становятся немного другими. Открываются другие участки на молекуле белка, которых раньше не было. И это позволяет организовать новую, а затем еще более новую серию взаимодействий. Это приводит к тому, что таким образом можно организовывать биологические каскады.

Белки редко действуют в одиночку: для участия в различных жизненно важных процессах внутри клетки эти макромолекулы с помощью белок-белковых взаимодействий собираются в мультибелковые комплексы.

Белок-белковые взаимодействия (ББВ) — обладающие высокой специфичностью физические контакты между двумя и более белками. Эти контакты образуются в результате биохимических событий с помощью электростатических взаимодействий, в том числе гидрофобного эффекта. Белок-белковые взаимодействия участвуют в таких важных клеточных процессах, как передача сигнала, клеточное общение, транскрипция, репликация, мембранный транспорт и другие.

Не все белок-белковые взаимодействия образуются раз и навсегда. Часть белков входит в состав стабильных комплексов, которые являются молекулярными машинами (например, АТФ-синтаза). Другие же белки собираются обратимо для осуществления какой-либо временной функции (например, для активации экспрессии генов в случае с транскрипционными факторами и активаторами).

Белковые сети – группы физически взаимодействующих белков, которые функционируют в клетке совместно и скоординированно, контролируя взаимосвязанные процессы, происходящие в организме. Анализ белковых сетей позволяет решать ряд задач фундаментальной медицины, среди которых необходимо выделить выявление и объяснение механизмов возникновения и развития заболеваний, включая опухолевые, нейродегенеративные, сердечно-сосудистые, аутоиммунные, а также поиск молекулярных мишеней для действия лекарств. Чтобы упростить сложную задачу визуализации, были разработаны различные биоинформатические инструменты, которые также позволяют сочетать информацию о ББВ с другими типами данных. К примеру, широко используется Cytoscape (платформа, предназначенная для визуализации белковых свзяей).

Метаболизм – это совокупность химических реакций в организме, которые обеспечивают его веществами и энергией, необходимыми для жизнедеятельности. Процесс метаболизма, сопровождающийся образованием более простых соединений из сложных, обозначают термином - катаболизм. Процесс, идущий в обратном направлении и приводящий, в конечном счете, к образованию сложного продукта из относительно более простых – анаболизм. Анаболические процессы сопровождаются потреблением энергии, катаболические – высвобождением.

Метаболические пути

Обычно данное исходное вещество превращается в продукт (или продукты) через ряд промежуточных соединений, в образовании которых принимают участие несколько ферментов, действующих последовательно один за другим. Такая

последовательность реакций составляет так называемый метаболический путь.

В клетке работает одновременно много метаболических путей. Реакции протекают согласованно, подчиняясь строгой регуляции, что объясняется специфической природой ферментов. Один фермент обычно катализирует только одну реакцию. Таким образом, ферменты служат для регулирования происходящих в клетке реакций и обеспечивают надлежащую их скорость. Пример метаболического пути – гликолиз.

Метаболиты – промежуточные продукты, образующиеся в процессе превращения. Метаболиты, являясь промежуточными соединениями биохимических реакций, играют очень важную роль в объединении различных биохимических путей, функционирующих в живой клетке. Уровень метаболитов зависит от активности ферментов, катализирующих их превращение.

Конечный продукт – последнее соединение метаболического пути.

Метаболом – это комплекс всех низкомолекулярных метаболитов с массой < 1500 Da, присутствующих в биологическом образце.

Билет 18.

1.Молекулярно-генетические маркеры. Их использование для идентификации организмов.

Вгенетике молекулярный маркер – это фрагмент ДНК, который связан с

определенным местом в геноме. Молекулярные маркеры используются в молекулярной биологии и биотехнологии для идентификации определенной последовательности ДНК в пуле неизвестной ДНК.

Молекулярный маркер соответствует гену или некодирующему участку генома, разные варианты (аллели) которого отличаются на уровне ДНК. Отличия на уровне ДНК (полиморфизм ДНК) могут быть выявлены:

•с помощью гибридизации с известными нуклеотидными последовательностями;

•при секвенировании нуклеотидной последовательности;

•при сравнении длины фрагментов, полученных с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР);

•в результате обработки ДНК эндонуклеазами рестрикции.

ДНК маркеры полезны в фундаментальных (напр.,в филогенетическом анализе и в поиске полезных генов) и прикладных исследованиях (напр., в маркерной селекции, при установлении отцовства и контроле движения пищевых продуктов).

ДНК-варианты являются следствием мутаций, происходящих вследствие замены одного нуклеотида (однонуклеотидный полиморфизм), вставок или потерь фрагментов ДНК разной длины (от одного до нескольких тысяч нуклеотидов), или дупликаций и инверсий фрагментов ДНК. ДНК-варианты классифицируются как «нейтральные» и «функциональные».

Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ/RFLP) определяется при использовании ферментов рестрикции (рестриктаз), которые разрезают ДНК только в точных местах «сайтов рестрикции» (например, рестриктаза EcoRI разрезает ДНК в сайте, определяемом палиндромной последовательностью GAATTC). В настоящее время наиболее часто ПДРФ/RFLP используют вслед за ПЦР, чтобы выявить аллели, отличающиеся по нуклеотидным последовательностям в сайте рестрикции. Фрагмент гена амплифицируется с использованием ПЦР и затем обрабатывается специфическим ферментом рестрикции, который разрезает только одну аллельную форму. Переваренные таким образом ампликоны затем разделяются электрофорезом.

Микросателлиты, или SSR (Simple Sequence Repeats), или STR (Simple Tandem Repeats) состоят из участков ДНК длиной в 2 – 6 п.о. – тандемно повторенных много раз (например, CACACACACACACACA). Они распространены по всему эукариотическому геному. Имеют относительно малые размеры и могут легко

амплифицироваться при использовании ПЦР на ДНК, экстрагируемой из различных источников. Полиморфизмы могут быть визуализированы на секвенирующем геле. Они гипервариабельны; часто имеют десятки аллелей по одному локусу, отличающихся один от другого по числу повторов. Их все еще предпочитают использовать для изучения разнообразия, а также для анализа отцовства и картирования локусов количественных признаков (QTL).

Минисателлиты обладают теми же характеристиками, что и микросателлиты, но длина повторов составляет 10-нескольких сотен пар оснований.

Полиморфизм длин амплифицируемых фрагментов (Amplified fragment length polymorphisms - AFLP) является методом ДНК-фингерпринта (отпечатки пальцев), который выявляет фрагменты рестрикции ДНК способом их амплификации в ПЦР.

STS маркер (Меченный сайт последовательности - Sequence Tagged Site) является ДНК последовательностью, которая встречается в геноме только раз в известном месте. Они необязательно бывают полиморфными и используются для построения физических карт.

SNP являются вариантами по одному нуклеотиду, которые не меняют общую длину последовательности ДНК в этом регионе. SNP встречаются по всему геному. Они широко распространены и встречаются в геноме человека с частотой один SNP на каждую 1000 пар оснований. Большинство SNP локализуется в некодирующих областях и не имеет прямого влияния на фенотип индивидуума. Однако некоторые введенные мутации в экспрессирующиеся последовательности или области, влияющие на экспрессию генов (промоторы, энхансеры), могут вызывать изменения в структуре белка или регуляции. Такие SNP предоставляют определенные возможности для выявления функциональных генетических вариантов.

Полиморфизм митохондриальной ДНК (мтДНК) широко используется в филогенетических исследованиях и при изучении генетического разнообразия. Гаплоидная мтДНК, которую несут митохондрии в цитоплазме клеток, имеет материнский характер наследования и высокую скорость мутирования; мтДНК не рекомбинирует – можно реконструировать эволюционные взаимосвязи между видами и внутри них на основании оценок распределения мутаций в мтДНК. МтДНК-маркеры могут также обеспечивать быстрый способ выявления гибридизации между видами или подвидами домашних животных.

Использование маркеров:

•Идентификация личности и судебная медицина. Определение степени родства. Восстановление родственных связей.