Добавил:
Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:

РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

.pdf
Скачиваний:
218
Добавлен:
09.05.2021
Размер:
1.43 Mб
Скачать

2.Структурная организация белковых молекул и ее иерархия. Элементы вторичной структуры белков.

1) Первичная структура – аминокислотная последовательность белка. Пептидные связи, возникающие в результате взаимодействии a-карбоксильных и a- аминогрупп аминокислот.

Свойства первичной структуры: 1) Последовательность аминокислот в первичной структуре белка является специфической видовой характеристикой данного белка. 2) Первичная структура белка является основой для формирования последующих структур белка за счёт взаимодействия радикалов аминокислотных остатков полипептидной цепи.

2)Вторичная структура – единица пространственной организации полипептидов. Происходит взаимодействие пептидных групп с образованием между ними водородных связей. Важная особенность вторичных структур: стабилизация за счет водородных связей между пептидными амидными и карбонильными группами (однако определенный вклад вносят и ковалентные связи – пептидные и дисульфидные).

Врезультате совокупности действия таких факторов, как:

-плоское строение пептидной связи;

-возможность свободного вращения связей у Сα-углеродного атома

-постоянство углов и межатомных расстояний

формируются следующие типы вторичной структуры белков: α-спираль, β-структура и β-складка.

3)Третичная структура (3D-структура) – пространственная структура белка – способ укладки цепи в определенном объеме. Характеризуется наличием биологической активности. Основной движущей силой формирования третичной структуры белка является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды. При этом гидрофобные радикалы втягиваются внутрь белковой молекулы, образуя там гидрофобную зону (гидрофобный карман), а гидрофильные радикалы ориентируются в сторону растворителя – воды.

Ограничение подвижности и тем самым формирование и поддержание третичной структуры возникает также за счёт общего вклада слабых нековалентных взаимодействий (водородные, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, гидрофобные взаимодействия и т.д.). Ковалентные – дисульфидные (-S – S-), сложноэфирные (между остатками глутаминовой и аспарагиновой кислот, с одной стороны, и оксиаминокислотами – с другой) и простые эфирные (например, между остатками серина); Процесс формирование нативной пространственной структуры полипептидной

цепи называют фолдингом (он может быть самопроизвольным, регулироваться ферментами или белками-шаперонами).

При образовании третичной структуры происходит формирование участков связывания молекулы белка с ЛИГАНДАМИ – соединениями, с которыми

избирательно взаимодействует данный белок. Эти участки белковой молекулы получили название САЙТОВ, или АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ (у белков – ферментов).

4)Четвертичная структура – взаимная пространственная ориентация комплекса белков либо нескольких независимо сфолдингованных для эффективного выполнения специфической функции белка.

Олигомер – белковая молекула, состоящая из нескольких полипептидных цепей Протомер (субъединица) – каждая входящая в олигомер цепь – протомером. Взаимное расположение субъединиц, т.е. способ их совместной укладки и упаковки с образованием нативной конформации олигомерного белка – четвертичная структура.

Четвертичной структурой обладает около 5% белков, в том числе гемоглобин, иммуноглобулины. Субъединичное строение свойственно многим ферментам. В стабилизации четвертичной структуры принимают участие те же типы взаимодействий, что и в стабилизации третичной. Субъединицы связаны друг с другом посредством лишь слабых нековалентных взаимодействий (ионных, водородных, гидрофобных). Причем субъединицы взаимодействуют друг с

другом только определенными участками своей поверхности (контактные участки).

Элементы вторичной структуры белков. Выделяют несколько основных структур, которые принимает полипептидная цепь: альфа-спираль, бета-листы, повороты и неупорядоченные петли.

Альфа-спираль представляет собой правозакрученный участок полипептида с шагом 3,6 аминокислотных остатка. Спирали включают в себя в среднем 12 аминокислот, но бывают и до 50. Структура возникает благодаря образованию водородных связей вдоль ее оси – все карбонильные группы обращены к C-концу, а NH-группы – к N-концу, навстречу карбонильным. Вордородные связи как бы сшивают спираль и не дают ей раскручиваться. Боковые радикалы аминокислот никак не участвуют в образовании спирали и обращены наружу.

Бета-листы (слои) образуются межу двумя расположенными рядом полипептидными цепями и стабилизируются водородными связями между карбонильными и NHгруппами соседних цепей. Бывают параллельные и антипараллельные (являются более стабильными, т.к. в этом случае водородные связи располагаются почти перпендикулярно пептидным, поэтому имеют меньшую длину). В пространстве представляет собой складчатые слои. Боковые радикалы ориентированы вне плоскости листа. образовании β-листов принимают участие все пептидные связи, т. е. создается довольно плотная сеть водородных связей, что придает структуре высокую стабильность.

Бета-поворот встречается на участках с пролином, боковой радикал которого очень жесткий. Поворот дополнительно фиксируется водородной связью глицинового остатка. В результате полипептидная цепь поворачивается на 180Г.

Некоторые элементы не упорядочены – это петли, повороты основной цепи и линкеры (находятся между упорядоченными элементами), неупорядоченные клубки.

Существуют супервторичные структуры – мотивы:

Повторяющиеся антипараллельные бета-листы – меандры

Повторяющиеся бета- и альфа-элементы – бета-альфа-бета-мотив

Укладка из 4-х бета-листов – греческий ключ

Билет 4.

1. Полимеразная цепная реакция (PCR) и области ее применения.

Полимеразная цепная реакция – это метод молекулярной биологии, который заключается в многократном увеличении малых концентраций определенных фрагментов ДНК в биоматериале.

Используется в медицине для диагностики генетических, иммунологических, онкологических заболеваний - везде, где нужно установить уникальную последовательность ДНК, опираясь на минимальное количество исходного ДНКсодержащего материала.

Реакционная смесь:

Праймеры – искусственно созданные олигонуклеотиды (15-30 п.о.), комплиментарные выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи. У праймеров, как и у любого олигоили полинуклеотида, есть 3ˊ- и 5ˊ-концы.

Нуклеотиды – материал для строительства цепей ДНК.

ДНК-полимераза – фермент, строящий комплементарную матричной цепь ДНК. Он может начинать синтез только от 3ˊ-конца праймера. Обычно используют термостабильные полимеразы, изначально выделенные из термофильных бактерий и архей: Taq-полимераза, PfuPwo. Первая — самая производительная, а две другие — более точные.

Буфер – раствор, который обеспечит оптимальные условия для протекания реакции, содержащий различные ионы для поддержания нужного рН, соли магния, необходимые для работы полимеразы, и неионный детергент Tween-20 в сочетании с BSA (бычьим сывороточным альбумином) для предотвращения налипания компонентов реакции на стенки пробирки. В случае ГЦ-богатых матриц в смесь часто добавляют энхансер — ДМСО (диметилсульфоксид), предотвращающий нежелательные взаимодействия между комплементарными участками матрицы.

20-30 циклов, каждый из которых состоит из 3 этапов:

1.Денатурация – нагревание реакционной смеси до 94 градусов – двойная цепь расплетается – водородные связи рвутся.

2.Отжиг праймеров – температура понижается, праймеры присоединяются к одноцепоченой ДНК с разных сторон копируемого участка, ограничивая фрагмент, который мы ищем (50-60 градусов).

3. Элонгация – ДНК-полимераза достраивает выделенный фрагмент ДНК (72 градуса).

При многократном повторении процедуры интересующие фрагменты ДНК накапливаются в геометрической прогрессии – из 1 фрагмента может получиться до 100 000 000 идентичных молекул => можно идентифицировать генетический материал, находящийся даже в самых малых количествах.

ПЦР с обратной транскрипцией. Обратная транскриптаза по матрице РНК строит комплементарную ДНК (кДНК). А потом с этой ДНК проводят обычную ПЦР. Диагностика некоторых видов рака по специфическим транскриптам опухолевых клеток, а также в генная инженерия, если нужно экспрессировать эукариотический ген в бактериальных клетках.

 

2 пробирки - 2 ферм

1 пробирка – 2 ферм

1 пробирка – 1 ферм

 

 

в первой при 37 °С по матрице

все реагенты смешивают

в присутствии

 

ионов

 

РНК синтезируют кДНК, затем

вместе, дают

отстояться

магния — полимер.акт-ность,

 

во второй

 

проводят

1 час

при

а в присутствии

 

ионов

 

стандартную ПЦР

 

37 °С и помещают

марганца —

 

 

 

 

 

 

 

в циклер

 

обратнотранскриптазн.

 

+

однажды проведя

обратную

время

проведения

обе реакции могут идти при

 

транскрипцию,

полученную

эксперимента

 

70 °С,

что очень

важно

 

кДНК

можно

использовать

существенно сокращается

в случае

ГЦ-богатых

РНК,

 

в нескольких

экспериментах

 

 

которые

охотно

образуют

 

с разными целями

 

 

 

«шпильки»

 

 

-

высока

вероятность ошибок

участвует

вся

в присутствии

марганца

 

при

 

пипетировании

синтезированная кДНК,

точность полимеразы сильно

 

и загрязнения

образца при

и повторить реакцию уже

снижается, и кДНК содержит

 

переносе во вторую пробирку

невозможно

 

множество ошибок.

 

 

 

для исследования

некоторого

при большом количестве

Tth-полимераза

 

-

 

набора генов

 

 

образцов,

но малом

термостабильная

 

 

 

 

 

 

 

количестве

изучаемых

из бактерии Thermus

 

 

 

 

 

 

 

генов

 

thermophilus HB-8

 

 

Применение ПЦР:

Медицина: анализ образцов на наличие инфекционных агентов; диагностика онкологических заболеваний, вызванных генными мутациями; диагностика наследственных заболеваний; подбор персонального лечения; отбор генетического материала для искусственного оплодотворения с учетом генетических мутаций.

Криминалистика: установление личности преступников и жертв по их ДНК, установление родства… Генная инженерия: клонирование ДНК для исследований, создание синтетических

ДНК, ГМО; секвенирование ДНК; анализ экспрессии генов в разных условиях Исследование пищевых продуктов на содержание генетических модификаций, определение пола у животных.

В антропологии, палеонтологии…

2.Основные принципы метода масс-спектрометрического анализа белков и его применение в биологии и медицине.

Масс-спектрометрия – мощный инструмент для определения молекулярной массы вещества (то есть можно использовать и для идентификации веществ).

Масс-спектрометрия позволяет определять:

1. Молекулярную массу вещества; 2. Молекулярную формулу вещества; 3. Строение вещества. (бомбардировка молекулы высоко активными электронами приводит к ее частичной деградации с образованием заряженных осколков. Характерный профиль этих осколков позволяет определить структуру молекулы (накоплена громадная база данных) или установить структуру элементов, входящих в ее состав) 4. Наличие изотопов=>происхождение в-ва 5. Идентификация молекул, элементный анализ В основе метода: способность заряженных частиц двигаться в магнитном поле. Траектория продвижения зависит от массы частицы, точнее, от соотношения ее массы к заряду.

Ионизация белка: ионизация– ионы создаются из белков в растворе, и это позволяет хрупким молекулам ионизироваться в целости и сохранности, иногда сохраняя нековалентные взаимодействия / матричная лазерная ионизация (MALDI) – белки встроены в матрицу, обычно в твердой форме, а ионы создаются импульсами лазерного света.

Как происходит:

1)Пептиды и белки, разделенные двумерным гель-электрофорезом или хроматографией, экстрагируют из геля и растворяют для анализа с помощью электроспрей-ионизации.

2)Электроспрей-ионизация— метод, применяемый в масс-спектрометрии, для получения ионов в газовой фазе из раствора. При этом растворы белков распыляются в атмосфере электрическим полем в виде заряженных капель в капилляр, соединенный с масс-анализатором. Биополимеры ионизируются в результате испарения капель раствора в вакууме и осаждения заряженных частиц (H+) на молекулах. Ионизация таким образом проходит без разрушения молекул) в специальной камере с помощью бомбардировки потоком высокоактивных электронов.

3)Пучок заряженных частиц попадает в постоянное (или переменное в зависимости от особенностей конструкции) магнитное поле, где ионы будут двигаться по искривленной траектории, радиус которой зависит от их массы. Траектория ионов фиксируется специальными датчиками с очень большой разрешающей способностью. Детектор, который поставит особенности движения молекул в электромагнитном поле в соответствие их молекулярной массе, а точнее, отношению молекулярной массы и заряда.

Проще говоря, если две разные молекулы несут одинаковый заряд, но отличаются по массе, приложение к ним одинакового электрического поля заставит их летать по-разному. Если обучить, то есть откалибровать детектор с использованием стандартов с заведомо известными массами, можно, оценивая движение неизвестных ионов, определять их отношение массы к заряду. Если заряд равен единице (то есть мы имеем дело с однозарядными ионами), отношение численно равно молекулярной массе.

С помощью масс-спектрометрии можно изучать протеом, метаболом и даже структуру белков; открывать новые маркеры заболеваний и даже исследовать гистологические препараты, идентифицировать белки с высокой степенью достоверности и определять их количества в сложных белковых смесях.

В медицине используются биологические маркеры. Они позволяют оценить состояние пациента во время лечения, определить исходы заболевания и предполагаемые результаты терапии. Для разработки новых диагностических критериев при острых инфекционных заболеваниях исследуется концентрация белков острой фазы. Существует bottom-up анализ – «снизу вверх» (метод идентификации белков и характеристики их аминокислотных последовательностей и посттрансляционных модификаций путем протеолитического расщепления белков перед анализом с помощью масс-спектрометрии, и top-down анализ, позволяющий идентифицировать белок путем изучения пептидов, полученных в ходе его ферментативного гидролиза.

Определение специфических белков, называемых биомаркерами, позволяет проводить раннюю диагностику в онкологии и кардиологии.

Выявление патогенных микроорганизмов по их белковому набору, в основном по рибосомальным белкам. Полученные результаты сопоставляются с базой данных массспектров.

Хромато-масс-спектрометрия – хроматография +масс-спектрометрия

1.Разделение сложной смеси на отдельные компоненты (газовая, газо-жидкостная или высокоэффективная хроматография)

2.Масс-спектрометрия

3.Идентификация веществ при использовании набора библиотек, в которых содержатся спектры для различных промышленных и научных сфер: медицины и фармакологии (гормоны, наркотики, лекарственные препараты), нефтедобывающей отрасли (углеводороды), экологии (пестициды и др органические загрязнители).

Билет 5.

1. Методы получения рекомбинантных генов. Химический и ферментативный синтез ДНК.

Рекомбинантные гены получают путем соединения гена с вектором. Существует несколько способов сшивания ДНК гена и ДНК вектора. Самым удобным признан способ, основанный на использовании так называемых липких концов. Липкими концами называют одноцепочечные участки ДНК, которые содержат 4—12 нуклеотидов. Такие участки легко получить, обработав ДНК специальным ферментом

— рестриктазой.

Ген и вектор сшиваются ферментом лигазой по бокам. Получается рекомбинантный вектор. Они содержат ориджины репликации, селективные маркерные гены, содержащие в основном ген устойчивости к антибиотику и уникальные сайты рестрикции.

Для того чтобы ввести рекомбинантный вектор в клетки, бактерии специально обрабатывают, что на короткое время делают оболочку проницаемой для вектора.

Весь процесс клонирования генов в бактериальных клетках состоит из следующих этапов:

выбор клонируемых генов и соответствующих им векторов;

рестрикция вектора и гена одной рестриктазой, соединение липких концов вектора и гена и лигирование химерной молекулы ДНК (in vitro);

трансформация — введение рекомбинантных ДНК в клетки;

амплификация химерных векторов (генов) внутри клетки (in vivo), получение клонов отдельных генов;

скрининг — отбор среди клонов трансформированных бактерий тех, которые содержат векторы, несущие нужный ген (по отношению этих клонов к антибиотикам или по особой окраске колоний);

создание условий для хранения клонированных генов (клонотеки геномов, генов);

обеспечение условий для экспрессии клонированных генов.

Синтез ДНК. Нужную последовательность ДНК можно получить химикоферментативным синтезом, при этом производят сборку полноразмерного гена из отдельных синтетических олигонуклеотидов различными способами.

Зачем синтезировать ДНК:

Получение кодирующих последовательностей или других фрагментов ДНК

Модификация известных фрагментов ДГК (кодонный состав, вторичные структуры – шпильки в ДНК, мешающие при трансляции, изменение свойств продукта)

Изучение свойств последовательностей ДНК (от отдельных компонентов до целых геномов)

Создание организмов с заданными свойствами

Химический синтез гена осуществляют, как правило, когда организм-донор ДНК не доступен или когда нуклеотидная последовательность природного гена может плохо транслироваться в выбранном организме-рецепиенте вследствие несовпадения частоты использования кодонов, а также по другим причинам.

Химический синтез ДНК. В 1970 г. в США в лаборатории Х.Г. Кораны впервые был осуществлен синтез гена. Синтез осуществляли ступенчато, присоединяя нуклеотиды один за другим. Полученные химическим синтезом фрагменты соединяли между собой с помощью ДНК-лигазы фага Т4.

Синтез олигонуклеотидов:

Праймеры

Зонды для ПЦР в реальном времени

Запасные части для построения более длинных молекул ДНК

Амидофосфитный метод (длина до 100 оснований): Твердофазная подложка –

стеклянная или шарики из полистерола. На этой подложке через 3’ОН-группу закреплен нуклеотид, а 5’ОН-группа заблокирована – защищена диметокситретилом, не может ни с чем реагировать. Химический синтез будет идти от 3’ к 5’концу. Далее убирается диметокситретильная защита, 5’ группа становится реакционноспособной – к ней и будет присоединяться следующее соединение. Добавляется амидофосфит нуклеозида – модифицированный нуклеотид, который станет следующим в цепи. Чтобы к 5’концу ничего не присоединилось, то его кэпируют. Чтобы присоединить следующий нуклеотид, нужно окислить фосфит и присоединить следующий нуклеотид в цепочку.

Чтобы выйти из этого цикла, нужно снять олигонуклеотид с подложки и удалить все защитные группы-для этого обработка гидроксидом аммония. На 5’конец добавляется фосфат, чтобы можно было получившиеся олигонуклеотид лигировать.

Синтез может производиться на колонке: подложка собрана в колонке, через которую химикаты, осуществляющие реакции, пропускаются по очереди, пока не будет получен олигонуклеотид. Процесс полностью автоматизирован – протекает в синтезаторах (до 1,5 тыс. олигонуклеотидов одновременно).

Синтез может производиться на чипах:

Фотолитография. На чипе находятся реакционные первоначально защищенные OH-группы, к которым должны присоединяться следующие амидофосфитнуклеозиды. Защитные группы – светочувствительные, то есть при

освещении светом они будут разрушаться, а на их месте будут оставаться только реакционноспособные ОН-группы. Освещая конкретные позиции на чипе, регулируется то, куда будет присоединяться следующий нуклеотид. Можно получать тысячи олигонуклеотидов одновременно, но по чуть-чуть+это очень дешево пос равнению с синтезом на колонке.

Микрофлюидные чипы – капельки, в которых происходит синтез.

Струйная печать.

Применяются также и другие амидофосфиты, позволяющие вводить в цепь продукта модифицированные нуклеозиды, различные метки и функциональные группы. В ходе синтеза эти реагенты поочерёдно, в порядке, задаваемом последовательностью целевого продукта, присоединяют к растущей на твердофазном носителе цепи. После завершения синтеза олигонуклеотид отделяют от носителя, удаляют защитные группы, использовавшиеся во время синтеза, и очищают полученный продукт при помощи электрофореза или хроматографии.

Ферментативный синтез ДНК

Лигирование. Можно получить множество олигонуклеотидов химическим путем, а потом «сшить» их с помощью tag-лигазы. После этого

получаеную цепь амплифицировать с помощью ПЦР при необходимости. Мало ошибок, потому что сборка идет без участия полимеразы, и дешево, так как синтезировать можно только одну цепь.

ПЦР. Известен способ получения ДНК путем проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР). Он заключается в последовательном повторении стадий: 1) плавления двуцепочечной ДНК-матрицы, 2) комплементарного взаимодействия (гибридизации или отжига) с ДНК олигонуклеотидных праймеров и 3) удлинения праймеров с помощью ДНК-полимеразы. При проведении ПЦР праймеры гибридизуются с концевыми участками целевого фрагмента ДНК и направлены таким образом, что синтез цепей осуществляется полимеразой вдоль участка, ограниченного праймерами. В результате каждого цикла происходит удвоение целевого фрагмента ДНК. Накопление целевого фрагмента ДНК в процессе ПЦР происходит экспоненциально, так как отжиг праймеров осуществляется и на вновь синтезированых цепях.

Термодинамически сбалансированная изнутри-наружу сборка. Подбирается сначала самый внешний олигонуклеотид, с некоторым перекрыванием подбирается следующий и т.д., доходим до середины. Затем с перекрыванием последнего нуклеотида подбирается следующий нуклеотид, но такой, который будет составлять другую цепь и так же олигонуклеотиды к нему, как в первой цепи. Все перекрывания имеют одну и ту же температуру плавления, при этом чем дальше от середины, тем большее кол-во праймеров.