РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

принадлежности виновника преступления, единственной уликой которого оказалась ДНК, оставленная на месте преступления.

Геном человека – совокупность наследственного материала, заключённого в клетке человека. По МАРКОВОЙ: суммарная ДНК гаплоидного набора хромосом и каждого из внехромосомных генетических элементов, для многоклеточного организма - содержащиеся в отдельной клетке зародышевой линии.

Хромосомы: Человеческий геном состоит из 23 пар хромосом, находящихся в ядре, а также митохондриальной ДНК. Двадцать две аутосомы, две половые хромосомы Х и Y, а также митохондриальная ДНК человека содержат вместе примерно 3,1 млрд пар оснований. В ходе выполнения проекта «Геном человека» была определена последовательность ДНК всех хромосом и митохондриальной ДНК.

Гены: в человеческом геноме широко представлен альтернативный сплайсинг. Альтернативный сплайсинг позволяет получить несколько различных белковых цепочек с одного гена. В результате человеческий протеом оказывается значительно больше протеома рассмотренных организмов.

Гены неравномерно распределены по хромосомам. Каждая хромосома содержит богатые и бедные генами участки. Эти участки коррелируют с хромосомными бендами (полосы поперёк хромосомы, которые видно в микроскоп) и с CG-богатыми участками. В настоящий момент значимость такого неравномерного распределения генов не вполне изучена.

Кроме генов, кодирующих белки, человеческий геном содержит тысячи РНК-генов, кодирующих транспортные РНК (tRNA), рибосомные РНК, микроРНК и прочие РНК, не кодирующие белок.

Регуляторные последовательности: регуляция – контроль экспрессии гена (процесс построения матричной РНК по участку молекулы ДНК). Обычно это короткие последовательности, находящиеся либо рядом с геном, либо внутри гена. Иногда они находятся на значительном расстоянии от гена. Идентификация регуляторных последовательностей в человеческом геноме частично была произведена на основе эволюционной консервативности (свойства сохранения важных фрагментов хромосомной последовательности, которые отвечают примерно одной и той же функции).

Прочие объекты: кодирующие белок последовательности составляют менее чем 1,5 % генома. Не учитывая известные регуляторные последовательности, в человеческом геноме содержится масса объектов, которые выглядят как нечто важное, но функция которых, если она вообще существует, пока не полностью выяснена. Эти объекты занимают до 97 % всего объёма человеческого генома. К таким объектам относятся: повторы, мобильные генетические элементы, псевдогены (нефункциональные аналоги структурных генов, утратившие способность кодировать белок и не экспрессирующиеся в клетке) и т.д.

Структура генома человека:

1,5%: Экзоны— участки ДНК, копии которых составляют зрелую РНК.

24%:

1)Интроны – участки ДНК, копии которых удаляются из первичного транскрипта и отсутствуют в зрелой РНК. Они не кодируют белки, но при этом являются важнейшей частью регуляции экспрессии генов. В том числе, обеспечивают альтернативный сплайсинг, который широко используется для получения множества вариантов белка из одного гена. Более того, некоторые интроны играют важную роль в широком спектре функций регуляции экспрессии генов, таких как нонсенс-опосредованный распад (систем клетки, осуществляющая контроль качества мРНК путем расщепленияя мРНК, которые содержат стопкодоны в неправильных местах (в открытых рамках считывания), предохраняет клетку от синтеза усечённых белков, которые могут оказаться опасными для клетки) и экспорт мРНК. Некоторые интроны сами кодируют функциональные РНК посредством постпроцессинга после сплайсинга с образованием некодирующих молекул РНК («руководят» избирательной посадкой репрессорных комплексов polycomb на определённые участки хроматина, а также направляют ДНК-метилтрансферазы и, возможно, регулируют избирательное метилирование ДНК).

2)Промоторы – последовательности нуклеотидов ДНК, узнаваемые РНКполимеразой как стартовые площадка для начала транскрипции. Промотор играет одну из ключевых ролей в процессе инициации транскрипции. То, под каким промотором находится кодирующий РНК участок ДНК, играет решающую роль в интенсивности экспрессии этого гена в каждом конкретном типе клеток. По активности промоторы делят на конститутивные (постоянный уровень транскрипции) и индуцибельные (транскрипция зависит от условий в клетке, например от присутствия определенных веществ или наличия теплового шока). Клетки эукариот содержат несколько типов РНК-полимераз. Транскрипцией мРНК занимается РНК-полимераза II вместе с набором белковых факторов транскрипции (связывают ДНК и способствуют инициации программы повышения – активаторы, или понижения транскрипции гена – репрессоры). Коровый промотор эукариот – это минимальный набор элементов последовательности, необходимый для связывания РНК-полимеразы II и транскрипционных факторов, вовлеченных в процесс старта инициации транскрипции.

3)Энхансеры – небольшой участок ДНК, который после связывания с ним факторов транскрипции стимулирует транскрипцию с основных промоторов гена или группы генов. Энхансеры не обязательно находятся в непосредственной близости от генов, активность которых они регулируют, и даже не обязательно располагаются с ними на одной хромосоме. Энхансеры также могут находиться внутри интронов. Тем не менее для работы энхансера необходим его физический контакт с промотором. Молекулярный механизм действия энхансера заключается в том, что он благодаря собранному на нём белковому комплексу привлекает РНК-полимеразу II и кофакторы транскрипции в область промотора.

4)Сайленсеры – последовательности ДНК, с которой связываются белкирепрессоры (факторы транскрипции). Связывание белков-репрессоров с сайленсерами приводит к понижению или к полному подавлению синтеза РНК

ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Также могут находиться вдали от промотора.

15%: Уникальные некодирующие последовательности

Пример:

44%: Повторы с мобильными генетическими элементами.

МГЭ – последовательности ДНК, которые могут перемещаться внутри генома. ДНК-транспозоны передвигаются по геному способом «вырезать и вставить» благодаря комплексу ферментов под названием транспозаза. Ретротранспозоны – процесс передвижения включает промежуточную стадию молекулы РНК, которая считывается с участка ретротранспозона и которая затем, в свою очередь, используется как матрица для обратной транскрипции в последовательность ДНК. Новосинтезированный ретротранспозон встраивается в другой участок генома.

15%: Повторы без МГЭ Микросателлиты, или короткие тандемные (простые) повторы, — варьирующие

участки (локусы) в ядерной ДНК и ДНК органелл (митохондрий и пластид), состоящие из тандемно повторяющихся мономеров длиной меньше 9 пар оснований. Характеризуются высокой скоростью изменения последовательностей, обусловленной «проскальзыванием» при репликации ДНК и точечными мутациями. Обладают высокой степенью полиморфизма. Увеличение их числа может стать причиной заболеваний.

Теломеры – концевые участки хромосом. Состоят из специализированной линейной хромосомной ДНК, состоящей из коротких тандемных повторов. Диспергированные повторы – повторяющиеся последовательности нуклеотидов в геноме. Отличаются от тандемных повторов тем, что расположены не последовательно друг за другом, а на расстоянии. Одно из наиболее изученных семейств диспергированных повторов — так называемое семейство Alu. В геноме обнаружено более миллиона повторов Alu-семейства, создающих по крайней мере 10% человеческой ДНК. В то же время в некоторых участках генома они занимают значительно более высокий процент ДНК.

Еще структуры:

Генетический инсулятор — это разграничивающий элемент, который играет две отдельные роли в экспрессии гена, первая это блокирование влияния энхансера, но чаще всего это барьер в распространении процесса конденсации хроматина на соседние области+ограничивают распостранение гетерохроматина на область с эухроматином, то есть препятствует спирализации ДНК там, где она расплетена.

2.Связь структуры и функции белковых молекул. Предсказание функции белка по его структуре.

Биологически активным белок становится, приобретая третичную структуру. Некоторые белки имеют четвертичную структуры – это иммуноглобулины. 1,2,3,4 По структуре белки классифицируют так:

четвертичную структуру или собираться в неупорядоченные агрегаты.

Предсказа́ние фу́нкции белка́— определение биологической роли белка и значения в контексте клетки. Предсказание функций проводится для плохо изученных белков или для гипотетических белков, предсказанных на основе данных геномных последовательностей. Источником информации для предсказания могут служить гомология нуклеотидных последовательностей, профили экспрессии генов, доменная структура белков, интеллектуальный анализ текстов публикаций, филогенетические и фенотипические профили, белок-белковые взаимодействия.

Методы предсказания функций:

•Основанные на структуре белка. Поскольку 3D-структура белка, как правило, является более консервативной, чем белковая последовательность, сходство структур может указывать на сходство и функций белков. Было разработано много программ для поиска похожих укладок внутри базы данных белковых структур (Protein Data Bank), например, FATCAT, CE, DeepAlign. В случае, когда для искомой белковой последовательности нет решенной структуры, сначала составляют вероятную трехмерную модель последовательности, на основе которой в дальнейшем делается предсказание функции белка; так работает, например, сервер по предсказанию функции белка RaptorX. Во многих случаях вместо структуры всего белка, поиск ведется по структурам отдельных мотивов, содержащим, например, сайт связывания лиганда или активный сайт фермента.

Другие методы:

•Основанные на гомологии. Белки, имеющие сходные последовательности, как правило, являются гомологичными и, стало быть, имеют сходную функцию. Поэтому в недавно секвенированных геномах белки обычно аннотируют по аналогии с последовательностями схожих белков из других геномов. Однако не всегда близкородственные белки выполняют одну и ту же функцию, например, дрожжевые белки Gal1 и Gal3 являются паралогами с 73 % и 92 % сходства, приобретшие в ходе эволюции очень разные функции: так, Gal1 является галактокиназой, а Gal3 — индуктором транскрипции.

•Основанные на мотивах последовательностей. Можно находить в искомой последовательности уже известные домены для предположения возможных функций. Также, внутри самих белковых доменов содержатся более короткие характерные последовательности, связанные с определенными функциями (так называемые мотивы), наличие которых в искомом белке можно определить поиском в базах данных мотивов, таких как PROSITE. Мотивы также могут быть использованы для предсказания внутриклеточной локализации белка: наличие особых коротких сигнальных пептидов предопределяет, в какие органеллы белок будет транспортирован после синтеза, и было разработано множество ресурсов для определения таких сигнальных последовательностей, например, SignalP, который обновлялся несколько раз по мере развития методов. Таким образом,

некоторые особенности функции белков можно предсказать без сравнения с полноразмерными гомологичными последовательностями.

•Основанные на геномном контексте. Основаны не на сравнении последовательностей или структуры, как описанные ранее, а на корреляции между новыми генами/белками и уже аннотированными: для каждого гена составляется филогенетический профиль (по наличию или отсутствию в различных геномах), которые затем сравнивают для установления функциональных связей (предполагается, что гены с одинаковыми профилями функциональны связаны друг с другом).

Ресурсы для работы:

UniProt (Universal Protein Resource) - один из наиболее всеобъемлющих каталогов информации о белках и их функциях, центральное хранилище первичных структур, объединяет базы первичных структур белков

Protein Data Bank, PDB — банк данных трёхмерных структур белков и нуклеиновых кислот. Информация, полученная методами рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии, и, всё чаще, методом криоэлектронной микроскопии

Catalytic Site Atlas – база данных для аннотации сайтов связывания лигандов и активных сайтов фермента в новых белковых последовательностях.

Pfam — база данных семейств белковых доменов.

PROSITE – база данных мотивов (характерные последовательности, связанные с определенными функциями)

Функционирование белков.

1)Активный центр белка и его взаимодействие с лигандом.

Воснове функционирования белков лежит специфическое взаимодействие активного центра белка с лигандом.

Центр связывания белка, активный центр – участок, сформированный радикалами аминокислот, далеко стоящими друг от друга в первичной структуре, имеющий уникальное строение для данного белка и способный специфично взаимодействовать с определенной молекулой или группой похожих молекул Лиганды – молекулы, специфично взаимодействующие с белками.

Высокая специфичность взаимодействия белка с лигандом обеспечивается комплементарностью структуры активного центра структуре лиганда (низкомолекулярные соединения, ДНК, РНК, полисахариды, другие белки).

Активный центр должен не только пространственно соответствовать входящему в него лиганду, но и между функциональными группами радикалов, входящих в активный центр, и лигандом должны образоваться связи (ионные, водородные, а также гидрофобные взаимодействия), которые удерживают лиганд в активном центре.

Кофакторы – лиганды, которые, присоединяясь к активному центру белка, выполняют вспомогательную роль в функционировании белков.

Сложные белки – белки, имеющие в своем составе небелковую часть Простетическая группа – небелковая часть, прочно соединенная с белком При присоединении к белкам специфических лигандов проявляется функция этих белков.

Примеры: 1) альбумин - важнейший белок плазмы крови - проявляет свою транспортную функцию, присоединяя к активному центру гидрофобные лиганды, такие как жирные кислоты, билирубин, некоторые лекарства и др. 2) Взаимодействие инсулина с рецептором вызывает изменение его конформации и активации сигнальных систем, приводящих к запасанию в гепатоцитах питательных веществ после еды.

2)Доменная структура и ее роль в функционировании белков.

Вдоменных белках центры связывания с лигандом часто располагаются между доменами. В некоторых белках домены выполняют самостоятельные функции, связываясь с различными лигандами. Такие белки называются многофункциональными.

Пример: трипсин - протеолитический фермент, который вырабатывается экзокринной частью поджелудочной железы и необходим для переваривания белков пищи. Он имеет двухдоменное строение, а центр связывания трипсина с его лигандом - пищевым белком - располагается в бороздке между двумя доменами. В активном центре создаются условия, необходимые для эффективного связывания специфического участка пищевого белка и гидролиза его пептидных связей.

Билет 16.

1. Геномы вирусов. Ретровирусы.

Вирус — неклеточный инфекционный агент, который может воспроизводиться только внутри клеток.

Пока вирус находится во внеклеточной среде или в процессе заражения клетки, он существует в виде независимой частицы. Важно: у них отсутствует энергетический обмен и аппарат трансляции (синтеза белка),

Вирусные частицы (вирионы) состоят из двух или трёх компонентов:

•генетического материала в виде ДНК или РНК (некоторые, например мимивирусы, имеют оба типа молекул);

•белковой оболочки (капсида), защищающей эти молекулы,

•в некоторых случаях, — дополнительных липидных оболочек.

Основа классификации: ДНК-содержащие (как правило, бактериофаги) и РНКсодержащие (подавляющее большинство).

Гены вирусов:

•структурные, кодирующие синтез белков, входящих в состав вириона;

•регуляторные – изменяют метаболизм клетки хозяина, регулируют скорость размножения вирусов.

Все вирусные геномы являются гаплоидными, кроме ретровирусов – у них диплоидный геном. Их геном образован однонитевой (+)РНК, образующей комплекс из двух идентичных субъединиц.

Геном вирусов:

•Может быть представлен одноцепочечными или двухцепочечными ДНК или РНК, либо гибридными (у некоторых семейств геном включает в себя как одноцепочечные, так и двухцепочечные участки).

•Может быть кольцевым или линейным – форма генома не зависит от нуклеиновой кислоты.

•Гены вирусов могут быть заключены в одной хромосоме или разделены на несколько блоков (хромосом), которые все вместе и составляют геном таких вирусов.

•Для РНК-содержащих вирусов: вирусы с положительным (плюс – нить РНК) геномом. Плюс – нить РНК этих вирусов выполняет наследственную функцию и функцию иРНК. Имеются также РНК-содержащие вирусы с отрицательным геномом (минус– нить РНК). Минус-нить РНК выполняет только

наследственную функцию.

Размер генома варьирует от 2000 нуклеотидов (кодирует 2 белка) до 1,2 млн пар оснований (кодирует более тысячи белков).

Сегментированный геном даёт эволюционные преимущества: различные

штаммы вируса с сегментированным геномом могут обмениваться генами и производить потомков с уникальными характеристиками. Это явление называется

реассортиментом. Для вирусов также характерная естественная рекомбинация.

Особенности групп:

ДНК-содержащие вирусы. Репликация генома у большинства ДНК-содержащих вирусов происходит в клеточном ядре. Если клетка имеет соответствующий рецептор на своей поверхности, эти вирусы проникают в клетку либо путём непосредственного слияния с клеточной мембраной, либо путём рецептор-зависимого эндоцитоза (чаще). Большинство ДНК-содержащих вирусов полностью полагаются на синтетический аппарат клетки-хозяина для производства их ДНК и РНК, а также последующего процессинга РНК. Однако вирусы с крупными геномами могут сами кодировать большую часть необходимых для этого белков. Все известные ДНК-содержащие вирусы позвоночных имеют геном, заключенный в одной хромосоме, линейной или кольцевой, одноили двухцепочечной.

ДНК-содержащие вирусы обычно имеют более крупные геномы благодаря большей точности их репликативных ферментов. Однако вирусы, содержащие одноцепочечные ДНК, являются исключением из этого правила — скорость накопления мутаций в их геномах приближается к таковой для вирусов, содержащих одноцепочечные РНК

РНК-содержащие вирусы. Геном РНК-содержащих вирусов представлен только линейными молекулами РНК. Репликация таких вирусов обычно происходит в цитоплазме. Механизм репликации определяется тем, является ли геном вируса одноцепочечным или двухцепочечным, вторым важным фактором в случае одноцепочечного генома является его полярность (может ли он непосредственно служить матрицей для синтеза белка рибосомами). Все РНК-вирусы используют собственную РНК-репликазу для копирования своих геномов. РНК-вирусы часто имеют сегментированный геном — это уменьшает вероятность того, что ошибка в одном из сегментов окажется фатальной для всего генома.

Ретровирусы. Они используют ДНК-копию генома как промежуточную молекулу при репликации. Используется обратная транскриптаза, или РНК-зависимая ДНКполимераза. Вирусы, использующие обратную транскрипцию, восприимчивы к противовирусным препаратам, ингибирующим обратную транскриптазу.

Ретровирусы – семейство РНКсодержащих вирусов, преимущественно позвоночных.

Представители (онковирусы): ВИЧ (лентивирусы), вирус саркомы Рауса (с онкогеном src), вирус опухоли молочной железы мышей

Геном диплоидный: 2 + цепи мРНК, 2 молекулы ревертазы в икосаэдрическом капсиде, состоящем из внутренних вирус-кодируемых белков.

Капсид окружен оболочкой из цитоплазматической мембраны клетки, от которой отпочковался вирус, модифицированный гликозилированными белками оболочки вируса (продукты гена env).

Вибрионы 80-100 нм в диаметре. Многие содержат онкогены в геноме.

Для репликации вируса нужно 3 вирусных гена (:

1)Gag (группоспецифичный антиген), кодирующий внутренние белки вирусной частицы;

2)Pol – направляющий синтез протеазы, обратной транскриптазы и интегразы;

3)Env – кодирует белки оболочки вируса.

IRES – элемент позволяет трансляцию вирусных белков по отдельности с одной мРНК. Это регуляторный участок мРНК эукариот и их вирусов, который обеспечивает кэпнезависимую, или внутреннюю инициацию трансляции. При таком механизме инициации рибосома связывается с мРНК непосредственно в районе IRES, которые чаще всего располагаются в 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) недалеко от сайта инициации трансляции, минуя стадии узнавания кэпа и сканирования.

Альтернативным сплайсингом образуется как полноразмерная (геномная) РНК, направляющая на рибосомах синтез продуктов генов gag и pol, так и сплайсированная РНК, являющаяся матрицей при синтезе белков оболочки (продукты гена env).

Эндогенные ретровирусы (ERV) – это эндогенные вирусные элементы в геноме, которые очень похожи на ретровирусы и могут быть получены из них

Цикл развития ретровирусов:

1)Вирус проникает внутрь клетки

2)Капсид разрушается и РНК вируса попадает в матрикс

3)Ревертаза транскрибирует РНК в ДНК

4)Вирусная ДНК интегрируется с ДНК клетки

5)Происходит транскрипция вирусной ДНК обратно в РНК и трансляция вирусных белков

6)Вирус снова собирается на плазматической мембране и выходит из клетки Ретровирусы встраивают ДНК, образующуюся в процессе обратной транскрипции, в

геном хозяина, такое состояние вируса называется провирусом. Провирус предпочтительно интегрирует в активно транскрибируемые участки генома. После интеграции в зародышевые клетки становится эндогенным (ERV) и передается потомкам: в геноме человека ERV 5-8%. Предполагается, что ретровирусы происходят от ретротранспозонов.