РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

•Картирование и исследование заболеваний. Диагностика.

•Определение предрасположенности к заболеваниям

•Предсказание фенотипических признаков

•Классификация заболеваний и пациентов и др.

•Определения совместимости донора и реципиента при трансплантации

•Эпидемиология

•Филогения

•Идентификация продуктов по ДНК (определение состава: соя, вид мяса, происхождение) и т. д.

2. Методы детекции белок-белковых взаимодействий.

Белок-белковые взаимодействия (ББВ) — обладающие высокой специфичностью физические контакты между двумя и более белками. Эти контакты образуются в результате биохимических событий с помощью электростатических взаимодействий, в том числе гидрофобного эффекта.

Белки — важные макромолекулы как для внутриклеточных, так и для внешних процессов. Белки редко действуют в одиночку: для участия в различных жизненно важных процессах внутри клетки эти макромолекулы с помощью белок-белковых взаимодействий собираются в мультибелковые комплексы. Они участвуют в таких важных клеточных процессах, как передача сигнала, клеточное общение, транскрипция, репликация, мембранный транспорт и другие.

Не все белок-белковые взаимодействия образуются раз и навсегда. Часть белков входит в состав стабильных комплексов, которые являются молекулярными машинами (например, АТФ-синтаза). Другие же белки собираются обратимо для осуществления какой-либо временной функции (например, для активации экспрессии генов в случае с транскрипционными факторами и активаторами)

Для стабильных комплексов:

1.Ко-осаждение. Когда белок-белковое взаимодействие основано на сродстве, когда комплекс достаточно долгоживущий, просто вызываем осаждение одного белка, а заодно он тащит за собой второй белок тоже. На основании этого можно судить о степени взаимодействия.

2.Реконституция комплекса при использовании очищенных компонентов (сборка рибосомы ин витро).

3.Гель-фильтрация (эксклюзионная хроматография). Комплекс будет идти медленнее, чем просто белок. Тут можно даже определить процент провзаимодействовавших белков.

4.Аналитическое центрифугирование. Считается скорость седиментации комплекса.

Если взаимодействие нестабильное (+можно регистрировать прямо в живой клетке):

5.Флюоресцентный резонансный энергетический перенос – безызлучательный перенос. Используется флуоресцентный белок и какую-либо флуоресцентную метку. Возбуждается один белок, а он передает свое возбуждение на другой, и этот белок излучает свет. Там идут опредленные потери энергии. Если белки близко – то вплоть до 100 процентов излучение, если подальше – могут наблюдаться два пика. (необратимое связывание, зато можно накопить

сигнал, что удобно для анализа редких комплексов).

6.Биолюменисцентный резонансный энергетический перенос. Например,

люцифераза. Она светит голубым светом. Сдвиг – энергия теряется при передаче (синий цвет более энергетически высок, следовательно, если наблюдается зеленый свет – произошло какое-то взаимодействие. Энергия передается по системе напряженных двойных связей с молекулы на молекулу, которые находятся на близком расстоянии. (можно использовать для оценке

динамики).

7.Метод идентификации супрессорных мутаций. Если взаимодействуют два белка, то они могут репрессировать друг друга.

8.Метод комплиментации белковых фрагментов. Чтобы белок мог быть репортером белок-белковых взаимодействий, нужно, чтобы он мог восстанавливать свою активность из отдельных фрагментов после сближения. Убиквитин – первый белок, который был использован для этого метода. Плюс должна быть простая система регистрации восстановления структуры репортера.

9.Генетический метод: Дрожжевой двугибридный анализ

In vivo. Дрожжевые клетки трансфицируют двумя плазмидами, первая из которых содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок X, сцепленный с BD доменом, а вторая кодирует белок Y, сцепленный с AD доменом. В результате ДНКсвязывающий домен совместно с белком X соединяется с определенной последовательностью репортерного гена, а с другим участком ДНК этого гена связывается AD домен совместно с белком Y. Так как участки ДНК репортерного гена, с которым связываются регуляторные белки, находятся достаточно близко друг к другу, без физического взаимодействия между белками X и Y активации репортерного гена не произойдет. По наличию продуктов экспрессии репортерного гена в клетках дрожжей можно судить о существовании взаимодействия между анализируемыми белками.

+Афинная хроматография с последующей масс-спектрометрией

Билет 19.

1.Технологии ДНК-микрочипов и их применение. ДНК-микрочипы (DNA microarray) в оценке уровня экспрессии генов.

ДНК-микрочип — технология, используемая в молекулярной биологии и медицине. ДНК-микрочип представляет собой множество небольших одноцепочечных молекул

— ДНК-зондов, которые ковалентно пришиты к твёрдому основанию. Каждый такой зонд имеет строго определённую последовательность нуклеотидов и место на микрочипе. Одинаковые зонды располагаются вместе, образуя сайт микрочипа.

ДНК-микрочипы используются для определения ДНК или РНК (обычно после обратной транскрипции), которые могут быть как белок-кодирующими, так и не кодировать белки. Используются для идентификации генов и их мутаций, связанных с различными заболеваниями; наблюдения за активностью генов; диагностики инфекционных заболеваний и определения наиболее эффективного метода антибиотикотерапии; скрининга микроорганизмов.

Экспрессионный анализ (профиль экспрессии) – измерение генной экспрессии посредством кДНК. На современных микрочипах можно полностью расположить целый геном, каждый известный ген которого будет являться зондом

Анализ на ДНК-микрочипе:

1.Выделение ДНК/РНК. Необходимо разрушить мембраны клеток, чтобы ДНК вышла в раствор (лизис с использованием ПАВ, протеиназы – расщепляет связывающие ДНК белки и буфера – поддерживает pH). Очистка от примесей центрифугированием, фильтрация на колонках. На этом этапе мы используем химические свойства ДНК, ее способность плохо растворяться в спиртах и хорошо – в воде. Мембрана со связанной ДНК несколько раз промывается спиртом, чтобы окончательно избавиться от примесей. Элюция – извлечение вещества из твердого носителя вымыванием.

2.Мечение ДНК/РНК. Этот процесс начинается с обратной транскрипции (если необходимо). Затем производят амплификацию целевого фрагмента при помощи полимеразной цепной реакции. В процессе ПЦР в состав фрагментов ДНК включаются нуклеотиды с флуоресцентными метками.

3.Гибридизация. Флуоресцентно-меченные амплифицированные образцы используются как мишени, для поиска на микрочипе комплементарных цепей, то есть способных образовывать прочные двойные цепи — дуплексы, по правилу комплементарности. Так как одна из цепей образуемого дуплекса меченая, то сигнал от такого дуплекса можно зарегистрировать.

4.Промывка. Как только заканчивается гибридизация, чип вынимают из раствора, содержащего образцы меченой ДНК. Сам чип потом тщательно промывается по определённым методикам, используя различные буферные смеси, центрифугирование и так далее.

5.Сканирование. Этот процесс предполагает использование оптических сканирующих приборов, способных детектировать фотоны с точно определённой длинной волны. Каждый сайт чипа освещается пучком света определённой длины волны, что активирует флуоресцентую метку. Чем выше интенсивность свечения точки, а значит там большое число образовавшихся дуплексов.

6.Анализ данных. Данные — массив значений интенсивности свечения каждого конкретного сайта микрочипа. Используя математические методы сравнения, можно достоверно установить сайты чипа, где произошла гибридизация, а

значит и узнать последовательность ДНК/РНК из образца.

Анализ экспрессии генов: Это самое частое применение ДНК-микрочипов. РНК, выделенная из культуры клеток, подвергается обратной транскрипции, в результате которой получается меченная кДНК.

Как делать: синтезировать из РНК их кДНК, пометить ее флуоресцентным красителем (не разделяя кДНК разных генов). Смесь нанести на микрочип, добиваясь, чтобы кДНК гибридизовалась с молекулами ДНК на чипе. Если место флуоресценции совпадает с положением молекулы ДНК, то в данной ткани этот ген экспрессирован. Кроме того, пометив кДНК из разных тканей разными красителями, можно изучать экспрессию сразу нескольких (обычно все-таки не больше 2) тканей на одном чипе.

Изготовление чипов:

•Струйная печать – зонды изготавливаются химическим способом, после чего прилепляются к подложке. Зонд наносится иглой в определенные точки либо используется принтер (чернила обычного струйного принтера заменены на капельки нанолитрового объема).

•Фотолитография (In-situ) – способ нанесения фотолитография. Использование ультрафиолетового света для нанесения групповых нуклеотидов. Для одной группы нуклеотидов необходимо четыре раза сменить фотолитографическую маску. Первая применяется для синтезирования нуклеотидов, три оставшиеся для предотвращения защитного снятия. Один чип генетического кода составлен из ста фотолитографических масок.

•High-density (Illumina) – использование цветного кодирования бусинок из кварца. Бусинки распределяются случайным образом на стекле из кварца, собранного в подложку. При таком типе диагностики в одном квадратном

миллиметре может быть собранно более сорока тысяч элементов.

Существует несколько различных способов внести метки в целевую молекулу:

•включение флуоресцентно меченных нуклеотидов в процессе синтеза кДНК или кРНК,

•использование биотин-модифицированных нуклеотидов, которые потом окрашиваются флуоресцентно-меченным стрептавидином,

•использование во время синтеза модифицированных нуклеотидов, на которые затем можно добавить флуоресцентную метку.

Меченная таким образом ДНК или РНК гибридизуется на микрочипе, после чего смывается. В каждой точке чипа детектируется флуоресцентный сигнал.

2. Протеомные карты нормальных и патологических тканей для разработки новых методов диагностики заболеваний.

Протеомная карта какой либо ткани/клетки – количественный и качественный набор белков ткани/клетки, отображает какие белки и сколько их есть в исследуемом образце. Если получить протеомные карты нормальных и патологических тканей, то по различиям в них можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического состояния, и выбрать их в качестве мишеней или использовать эти знания для диагностики.

Что можно получить:

•дешевые и доступные каждому методы медицинской диагностики, которые позволяют определять самые ранние стадии развития заболеваний.

•индивидуальные методы лечения заболеваний, которые в настоящее время считаются неизлечимыми.

•создание новых методов биоинформатики и новых технологий, позволяющим исследователям работать в низких концентрациях.

Молекулярная (протеомная) диагностика является достоверным инструментом диагностики ранних стадий онкологических заболеваний и конкретно диагностики "молчащих раков", не проявляющих себя до тех пор, пока лечить его не станет поздно. Традиционные методики верификации рака подразумевают проведение биопсии, то есть забора микропорции ткани. Альтернатива – протеомная диагностика.

Медицинский аспект проблемы - установить корреляцию между набором белков и началом или развитием болезни. Задача сходна с геномикой, где определяется зависимость между болезнью и геномом, но на порядок сложнее, т.к. белков гораздо больше, чем генов. ДНК можно амплифицировать с помощью ПЦР, белки – нет. Следовательно, методической основой протеомики является подход, при котором чувствительность приборов позволяет регистрировать отдельные молекулы.

Проект "Протеом человека" – планирует конструирование протеомной карты всех белков человека. Первоочередные задачи проекта "Протеом человека" - составление протеомных карт плазмы крови, печени и мозга.

Схема проведения протеомного анализа: основана на масс-спектрометрии.

1.Разделение образца (например плазма крови) методом двумерного электрофореза, и на двумерной электрофоре-грамме каждый белок предстает в виде отдельного пятна. Его интенсивность соответствует уровню экспрессии

белка, то есть его количеству. Анализ гелей позволяет выявить индивидуальные вариации протеома, оценить статистические параметры для каждого пятна.

2.Затем, сравнивая электрофореграмму с эталонными, удается выявить различия, связанные с заболеваниями. Различия заключаются в повышении или понижении экспрессии белка, некоторые белки появляются в плазме больных, тогда как другие могут исчезнуть. Однако на этапе анализа двумерных электрофореграмм речь на самом деле еще не идет о конкретных белках, а только об интенсивности пятен. Для того чтобы определить (идентифицировать) белок, пятно вырезают из геля, подвергают расщеплению, и массы фрагментов (пептидов) детектируют с помощью масс-спектрометрии.

Билет 20.

1. Повторяющиеся элементы геномов. Подвижные генетические элементы. Повторяющиеся последовательности ДНК — участки ДНК, включённые в геном,

последовательность которых состоит из повторяющихся фрагментов. Участвуют в регуляции экспрессии генов, в процессинге РНК, структурную функцию, повышает точность гомологичного спаривания и рекомбинации, способствует успешной репликации ДНК и, возможно, является носителем принципиально иного генетического кода с неизвестной функцией.

Выделяют 2 типа таких повторяющихся последовательностей:

• Тандемные повторы.

oСателлитная ДНК – характерный компонент эукариотического генома, состоящий из тандемно организованных повторов нуклеотидных последовательностей. Сателлитная ДНК не кодирует белки и локализована в конститутивном гетерохроматине хромосом. Характерна для теломерных и центромерных областей хромосом. Длина от 2 до нескольких сотен п.о.

oМинисателлиты – в эухроматине. 10-100 пар оснований. Используются как маркеры.

oМикросателлиты – в эухроматине. Менее 10 пар оснований. Используются как маркеры.

•Диспергированные повторы – отличаются от тандемных повторов тем, что расположены не последовательно друг за другом, а на расстоянии. Встречаются

вэукариотических и прокариотических геномах (до 42 процентов в геноме).

oБез LTR – Длинный концевой повтор – идентичные послежовательности на концах ряда генов. Элемент, окруженный парой LTR, будет кодировать обратную транскриптазу и интегразу., позволяя копировать элемент и вставлять его в другое место генома.

▪SINEs – короткие диспергированные повторы. В геноме эукариот, появившиеся в результате обратной транскрипции коротких молекул РНК. Не кодируют белки и их транспозиция в геноме зависит от других мобильных элементов. 80-500 баз. Производные тРНК. Пример, Alu. 300 п.о. Содержат последовательность распознавания рестрикционного энзима AluI.

▪LINEs – ретротранспозоны. Несколько тыс. п.о. На 3'-конце содержат либо поли(A)-хвост, либо аденин богатую последовательность, либо тандемно-повторяющиеся последовательности. Содержат одну или две открытые рамки

считывания.

oLTR-содержащие (~100 bp - 5 kb) – отличатся от эндогенных ретровирусов и их остатков отсутствием гена env (кодирует вирусную оболочку). Изменяют активность генов, обеспечивают эволюцию геномов

•Транспозоны с генами транспозиции (cut and paste) Транспозазой и Резольвазой. Редкие для человека. Транспозиция как раз и является причиной повышения устойчивости бактерий к антибиотикам в целых популяциях.

2. Понятие о протеоме. Разделы протеомики.

Протеом — совокупность экспрессированных белков в данном типе клеток или в организме, в данный период времени при данных условиях. Проще: совокупность белков организма, производимых клеткой, тканью или организмом в определённый период времени.

Протеом не сводится к сумме последовательностей аминокислот, составляющих первичную структуру белков. Протеом включает в себя также пространственные структуры всех содержащихся в нём белков (вторичная, третичная структура и четвертичная структуры белков) и функциональное взаимодействие между ними.

Протеом, особенно у эукариот, больше, чем геном, то есть количество белков превышает количество генов. Это связано с:

•альтернативным сплайсингом (вариант сплайсинга (мРНК), при котором в ходе экспрессии гена на основе одного и того же первичного транскрипта (пре-мРНК) происходит образование нескольких зрелых мРНК)

•посттрансляционной модификацией белков, например, их гликозилированием (ферментативный процесс, в ходе которого происходит присоединение остатков сахаров к органическим молекулам) и фосфорилированием (процесс переноса

остатка фосфорной кислоты от фосфорилирующего агента-донора к субстрату). В то время как геном определяется последовательностью нуклеотидов, протеом не

сводится к сумме последовательностей аминокислот. Протеом включает в себя также пространственные структуры всех содержащихся в нём белков и функционального взаимодействия между ними.

Протеомика — наука о протеомах, развивалась в значительной степени путём разделения белков методом двумерного электрофореза.

Протеомика

Исследует совокупность белков организма – протеома.

Характеризация всех белков организма или исследование структуры и функции белка.

Разделы: Структурная протеомика: изучение структуры всех белков и их распределение в клетке Функциональная протеомика: исследование функции всех белков, их

взаимодействие друг с другом и другими биомолекулами Экспрессионная протеомика: изучение качественного и количественного уровней

экспрессии белков в клетке на различных стадиях развития и в различных условиях

Методы: 1) Выделение белков, электрофоретическое разделение, расщепление на мелкие фрагменты, масс-спектрометрия для определения последовательностей, идентификация по стандартным базам данных 2)Предсказание и идентификация пространственной структуры белков

3)Исследование экспрессии белков и экспрессионных профилей клеток на микрочипах (микроэрреи)

Белковый микрочип - технология, применяющаяся в молекулярной биологии. Белковый микрочип представляет собой твердую подложку(основание), на которую ковалентно пришиваются тысячи различных белков (антигены, антитела, ферменты и т.д.) в различных точках микрочипа. Каждый отдельный белок формирует область своей высокой концентрации на микрочипе.

Аналитические микрочипы: Данные микрочипы обычно используются для профилирования сложной смеси белков: измерения сродства, специфичности, уровня экспрессии белка в смеси. В данной методике библиотеки антител, аптамеров, антигенов наносятся на твердые подложки, составляющие основу микрочипа. Далее такой чип погружается в белковую смесь, для которую надо профилировать. Белковые микрочипы с использованием антител были наиболее распространенными в 00-х годах 21 века. Аналитические микрочипы могут быть использованы для поисков дифференциальной экспрессии и в клинической диагностике. В качестве примера можно привести сравнение здоровых и больных тканей, а также ответ ткани на изменение условий окружающей среды.

Функциональные микрочипы: Данный тип микрочипов отличается от аналитических тем, что на твердом основании располагаются полностью функциональные белки или домены, а не аналитическая триада (антитела, аптамеры, антигены). Такие микрочипы позволяют анализировать биохимическую активность целого протеома в единственном эксперименте. Кроме того, используются для изучения многочисленных взаимодействий белков с другими белками, ДНК, РНК, липидами, низкомолекулярными лигандами.

Обратно-фазовые микрочипы (ОФМ): При изготовлении микрочипов данного типа клетки, изолированные из разных тканей подвергаются лизису. Лизат наносится на нитроцеллюлозную мембрану при помощи специальной машины - формируя микрочип, затем каждая ячейка полученного микрочипа анализируется разными антителами против интересующего белка. Данный тип микрочипов позволяет обнаружить белки, или их конформационные изменения, которые появляются только во время определенных болезней.

Билет 21.

1.Организации бактериального генома. Фактор фертильности и половой процесс у бактерий.

Основной объем генетической информации бактериальной клетки заключен в ее единственной хромосоме. Размер генома у разных бактерий – от нескольких сотен тысяч пар нуклеотидов (п.н.) до нескольких миллионов п.н. У E. coli он равен 4,6 млн. п.н., а его кодирующая часть составляет 88,6%.

Всостав бактериальных геномов входят:

•независимые гены – их работа не регулируется другими генами, экспрессия носит конститутивный характер (непрерывный). От соседних генов независимые гены отделены некодирующими участками (спейсерами), которые обычно не транскрибируются.

•Опероны — это группа рядом расположенных структурных генов, имеющих общую систему регуляции. Обычно эти гены участвуют в осуществлении

последовательных этапов какого-либо биохимического процесса.

Лактозный оперон: в систему лактозного оперона входят три структурных гена (Z, Y, A), кодирующие три фермента, участвующие в процессе сбраживания молочного сахара (см. схему). Основным ферментом является β-галактозидаза.

Ген-регулятор – вне оперона – кодирует белок-репрессор, который может связывать с оператором и регулировать тем самым транскрипцию.

Оперон:

•Промотор – сюда будет присоединять РНК-полимеразу.

•Оператор – сюда присоединяется белок-репрессор. Когда нет лактозы – он сидит на операторе, РНК-полимераза не может сдвинуться с места. Когда есть лактоза

– она взаимодействует с белком репрессором и ферменты для расщепления могут быть синтезированы.

•Структурные гены – гены ферментов, которые будут расщеплять лактозу.

•Терминатор – останавливает транскрипцию, когда вся лактоза переработана.

Увеличение объема генома прокариот:

•копирование имеющихся генов

•включение в геном чужеродной генетической информации

o Трансформация – включение в геном фрагментов чужеродной ДНК, в результате чего клетка приобретает новый признак.

o Конъюгация – между двумя бактериальными клетками возникает контакт с образованием цитоплазматического мостика, по которому из одной клетки в другую поступает ДНК.

Основная роль в этом процессе принадлежит половому фактору бактерий — F- плазмиде, внехромосомному носителю информации. Клетки, несущие эту плазмиду