РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

(F+), в процессе конъюгации играют роль доноров, а не имеющие ее (F-) – реципиентов. Переход плазмиды из клетки-донора в клетку-реципиент инициирует процесс обмена между ними генетической информацией, т.к. вслед за F-фактором может переноситься бактериальная хромосома.

Отличие от полового процесса высших организмов: неполная передача наследственного материала (хромосомы) от донора к реципиенту, благодаря чему образуется частичная зигота — мерозигота (весь процесс был назван меромиксисом).

oТрансдукции – перенос информации от одной бактериальной клетки к бактериофагами. Долго могут быть в состоянии провируса. Затем вирус активизируется, выходит из состава хромосомы, “прихватывая” близлежащий фрагмент ДНК бактерии. Следом начинается процесс репликации вирусной ДНК и вместе с нею фрагмента хромосомы. Затем синтезируются вирусные белки и идет сборка новых вирусных частиц, в

геном которых включается фрагмент бактериальной ДНК.

oТранспозиции – это перемещение участка хромосомы из одного места в геноме (локуса) в другой. У бактерий известно два типа транспозирующих

элементов: IS-частицы (инф-ция только о вырезании и вставке) и транспозоны (могут содержать структурные гены).

Плазмида — это экстрахромосомный носитель наследственной информации. Количество плазмид в клетке непостоянно. Плазмиды бывают мелкие и крупные,

однокопийные и мультикопийные. Однокопийные – встраиваются в бактериальную хромосому и реплицируются вместе с ней. Их называют эписомами. Мультикопийные – существуют автономно и реплицируются независимо от бактериальной хромосомы. Число копий их различно. Некоторые плазмиды (например, F-фактор) могут попеременно находиться либо в интегрированном, либо в автономном состоянии. Плазмидная ДНК определяет такие свойства бактериальной клетки, как устойчивость к антибиотикам (R-плазмиды), синтез колицинов — веществ, подавляющих рост других типов бактерий (Col-плазмиды) и др. Многие плазмиды обладают способностью к трансмиссии, т.е. к переходу из одной клетки в другую. Внутри плазмид могут находиться транспозоны.

2.Компьютерный анализ белковых последовательностей. Предсказание функции белка на основании нуклеотидной последовательности.

Анализ в большинстве случаев проводится с использованием компьютерных программ и белковых баз данных. Компьютерный анализ позволяет предсказать или

определить:

- Клеточную локализацию по наличию молекулярного адреса (секретируемый, митохондриальный, мембранный, ЭР и т.д.) - Предсказание продуктов расщепления протеазами - Предсказать физико-химические параметры: Mr, pI и др. - Профиль гидрофильности /гиброфобности, трансмембр уч-ки. - Посттрансляционные

UniProt (Universal Protein Resource) - один из наиболее всеобъемлющих каталогов информации о белках и их функциях, центральное хранилище первичных структур, объединяет базы первичных структур белков

Protein Data Bank, PDB — банк данных трёхмерных структур белков и нуклеиновых кислот. Информация, полученная методами рентгеновской кристаллографии или ЯМР-спектроскопии, и, всё чаще, методом криоэлектронной микроскопии

Catalytic Site Atlas – база данных для аннотации сайтов связывания лигандов и активных сайтов фермента в новых белковых последовательностях.

Pfam — база данных семейств белковых доменов.

PROSITE – база данных мотивов (характерные последовательности, связанные с определенными функциями)

Билет 22.

1. Эукариотический геном. Генетический аппарат органелл.

Геном – суммарная ДНК гаплоидного набора хромосом и каждого из внехромосомных генетических элементов, для многоклеточного организма – содержащиеся в отдельной клетке зародышевой линии.

1.Хромосомная ДНК. Эухроматин — участки хроматина, сохраняющие деспирализованное состояние в покоящемся ядре. Гетерохроматин – спирализованное состояние, низкая транскрибируемость.

2.Внехромосомная ДНК: михондриальная или хлоропластная ДНК.

3.Подвижные генетические элементы: ретротранспозоны, вирусы

Особенности:

•Генетический материал имеется не только в ядерном аппарате (хромосомах ядра), но и некоторых органоидах, поэтому геном эукариот состоит из нескольких разных компонентов.

•Ядерный геном содержит ядерные гены и называется нуклеомом.

•Митохондриальный геном содержит митохондриальные гены и называется хондриомом.

•Пластидный геном содержит пластидные гены и называется пластидомом.

•Имеется экзон-интронная структура (мозаичное строение).

•Каждый транскриптон включает в себя, как правило, только один структурный ген.

•Наличие избыточной ДНК

•Нуклеосомное строение хромосом – структурная часть хромосомы, образованная совместной упаковкой нити ДНК с гистоновыми белками.

Митохондрия – полуавтономная саморазмножающаяся цитоплазматическая органелла, осуществляющая реакции клеточного дыхания с синтезом АТФ в процессе транспорта электронов и окислительного фосфорилирования. (число от нескольких 10 до 1000 на клетку).

Мт геном – кольцевая ДНК (иногда линейная). У животных в одной М-ии может быть от 2 до 50 молекул ДНК. М. геном кодирует некоторые мит-е белки, субъединицы комплексов дыхательной цепи, большинство митРНК, за исключением нек-х малых РНК и части тРНК. Остальное кодирует ядерный геном. Некоторые м-е гены представлены копиями и в ядерной геноме.

У растений: Растительные митохондрии сильно отличаются от митохондрий животных. Они имеют дополнительные пути электронного транспорта, не сопряженные с синтезом АТФ. Больше по размеру.

У человека митохондрии: передается по материнской линии, очень изменчив, 5% от всего генома, центр контроля апоптоза.

Хлоропласты – геном кольцевой, представлен во многих копиях на одну пластиду, которых до десятков в клетке.

Система трансляции хлоропластов очень схожа с бактер-ной и представлена 70S рибосомами, собственными тРНК и аа-тРНК-синтетазами, многочисленными факторами трансляции и т.п.

2.Взаимодействия, обеспечивающие формирование и поддержание пространственной структуры белка.

Существуют пять типов взаимодействий, сочетание которых обеспечивает формирование и поддержание пространственной структуры белка:

•водородные связи между R-группами аминокислотных остатков;

•электростатическое притяжение между противоположно заряженными R группами;

•гидрофобные взаимодействия (гидрофобные R-группы некоторых аминокислотных остатков избегают контактов с водным окружением и стремятся собраться вместе внутри белковой структуры, где они защищены от соприкосновения с водой);

•вандерваальсовы взаимодействия (из-за флуктуаций электрического поля любые два атома на очень близких расстояниях слабо притягиваются;

•ковалентные поперечные связи (некоторые белки содержат остатки цистеина, которые способны образовывать дисульфидную ковалентную связь, легко разрывающуюся при обработке различными веществами-восстановителями).

Связи, поддерживающие третичную структуру, еще слабее водородных. Их называют гидрофобными. Это – силы сцепления между неполярными молекулами или неполярными радикалами. Хотя гидрофобные силы сцепления относятся к слабейшим связям, но благодаря их многочисленности они в сумме дают значительную энергию взаимодействия. Участие «слабых» связей в поддержании специфической структуры белковой макромолекулы обеспечивает достаточную ее устойчивость и вместе с тем высокую подвижность.

У некоторых белков в поддержании третичной структуры макромолекулы существенную роль играют так называемые –S–S–(эс-эс-связи) дисульфидные ковалентные связи, возникающие между радикалами аминокислоты цистеина (цис), находящимися на удаленных друг от друга участках полипептидной цепи.

Билет 23.

1.Происхождение и эволюция эукариотического генома. Взаимосвязь сложности генома и его размера.

Внутриклеточные эндосимбионты, которые первоначально произошли от свободноживущих прокариот, сыграли важную роль в эукариотической эволюции, породив два цитоплазматических органоида. Митохондрии развились из α- протеобактерий, а хлоропласты — из цианобактерий. Оба органоида внесли весомый вклад в совокупный генόм эукариотических ядер. Включения митохондрий и хлоропластов в эукариотическую линию посредством эндосимбиоза и дальнейшей параллельной эволюции ядерного и органоидных геномов.

Несмотря на множество сообщений о горизонтальном переносе генов из прокариот в эукариоты и между эукариотами, комплексные исследования всех деревьев не выявили никаких доказательств кумулятивного эффекта непрерывного ГПГ на эволюцию эукариотических геномов.

Это указывает на одну из следующих возможностей:

•перенесенные горизонтально гены, специфичные для определенных линий, быстро элиминируются;

•восприимчивые к ГПГ линии не дают начало эволюционно стабильным потомкам (тупиковы);

•многие предполагаемые продукты ГПГ на самом деле не являются линияспецифичными, и при расширении аналитической выборки эукариот они будут обнаружены у других отдаленных родственников, что докажет причинную роль дифференциальной потери в возникновении неоднородности распределения генов;

•возможна любая комбинация описанных вариантов.

Эволюция эукариот связана с нарастающим увеличением количества ДНК. На фоне такого увеличения большая часть ДНК является «молчащей», т.е. не кодирует аминокислот в белках или последовательностей нуклеотидов в рРНК и тРНК.

Увеличение ДНК осуществляется различными способами:

•Наиболее резко размер генома изменяется в результате полиплоидизации, которая достаточно широко распространена в природе - увеличение количества ДНК и хромосом, кратном гаплоидному.

•Хромосомные перестройки, сопровождающиеся изменением содержания ДНК в них, такие, как дупликации, делеции и транслокации. Они обусловливают повторение, утрату некоторых последовательностей в составе хромосомы или перенос их в другие хромосомы.

•Амплификация нуклеотидных последовательностей -образование их копий, что приводит к возникновени повторяющихся участков ДНК. Особенностью генома эукариот является наличие таких повторов в большом количестве, свидетельствующее о существенном вкладе механизма амплификации в

увеличение размеров наследственного материала.

Конкретные изменения, приводящие к амплификации, бывают различными. Появление тандемов повторяющихся последовательностей объясняется, например, неравным кроссинговером, вследствие которого возникают многократные дупликации отдельных участков ДНК. Возможна амплификация путем вырезания фрагмента с последующей его репликацией вне хромосомы и встраиванием копий в другие хромосомы. Предполагают также амплификацию, осуществляемую путем «обратной транскрипции» ДНК на РНК с участием фермента обратной транскриптазы с последующим встраиванием копий ДНК в различные локусы хромосом.

Дивергенция амплифицированных последовательностей с образованием разных генов или их семейств обусловлена накоплением в них различных изменений в виде замен оснований или других генных мутаций.

Транспозоны: определенная роль в эволюции принадлежит подвижным генетическим элементам — транспозонам. Они представляют собой автономные единицы, несущие в нуклеотидной последовательности информацию о структуре особых белков, которые обеспечивают их способность к перемещению из одного участка генома в другой.

Размер генома - это общее количество ДНК, содержащееся в одной копии одного полного генома.

Размеры геномов разных видов значительно отличаются друг от друга даже в пределах рода, животные до 3300 раз, растения до 1000. При этом часто не наблюдается корреляции между уровнем эволюционной сложности вида и размером его генома.

Гомологичные гены - гены, имеющие сходную первичную структуру (последовательность нуклеотидов), общее происхождение и контролирующие один и тот же признак. Гомологичные гены могут возникать в геноме в результате удвоения (дупликации) одного гена (такие гомологичные гены называют паралогами или присутствовать у разных организмов сохранившимися от общего предка (такие гомологичные гены называют ортологами).

Паралоги - возникают в результате дупликации гена и могут разойтись в процессе эволюции настолько, что начнут выполнять разные функции. Возникают путем внутригеномных дупликаций и могут эволюционировать с приобретением новых функций. Паралогичные гены обеспечивают видам адаптацию к меняющимся условиям окружающей среды.

Ортологи - это гомологичные белки из разных организмов, разошедшиеся в процессе видообразования и выполняющие одну и ту же функцию (чаще всего). Кодируют строение ключевых макромолекул клетки, участвующих в процессах репликации, транскрипции, трансляции и репарации генетического материала. Мутации ортологов, как правило, летальны. Типичный пример ортологичных генов - гистоновые гены, кодирующие белки гистоны (HI, H2A, Н2В и НЗ), участвующие в образовании нуклеосом при первом уровне компактизации ДНК в составе хромосом.

Ксенологи. Гены, попавшие в организм при горизонтальном переносе из другого организма, называются ксенолагами.

2.Перспективы молекулярной диагностики заболеваний на основе исследований протеома.

Протеомная карта какой либо ткани/клетки – количественный и качественный набор белков ткани/клетки, отображает какие белки и сколько их есть в исследуемом образце.

Протеомная карта заболевания – это понимание развития клинической картины заболевания в виде количественных и качественных нарушений на геномном, транскрипционном, трансляционном и посттрансялционном уровнях функционирования организма, т.е. на уровне нарушений в составе и взаимодействии генов в ДНК, РНК, белков, липидов, углеводов, а также на уровне образующихся в клетке и взаимодействующих между собой метаболитов.

Важно подчеркнуть, что наличие подобных нарушений часто указывает лишь на вероятность развития патологии, следовательно можно, повлияв на факторы внешней среды, снизить вероятность развития заболевания, если провести соответствующие индивидуальные профилактические мероприятия.

Молекулярная (протеомная) диагностика является достоверным инструментом диагностики ранних стадий онкологических заболеваний и конкретно диагностики "молчащих раков", не проявляющих себя до тех пор, пока лечить его не станет поздно. Традиционные методики верификации рака подразумевают проведение биопсии, то есть забора микропорции ткани. Альтернатива – протеомная диагностика.

В глобальном масштабе протеомика занимается инвентаризацией всех белков организма.

Медицинский аспект проблемы - установить корреляцию между набором белков и началом или развитием болезни. Задача сходна с геномикой, где определяется зависимость между болезнью и геномом, но на порядок сложнее. Дело в том, что белков намного больше, чем генов. Число последних оценивается в 30-40 тыс., однако

каждый ген может считываться во множестве (до 200) альтернативных вариантов, а значит, белков может быть значительно больше - до 6-8 млн. в одной клетке. Причем конкретный белок может быть экспрессирован как в виде единичных молекулярных копий, так и в огромном количестве - налицо широкий диапазон концентраций белков

вклетке и биологических жидкостях. Можно возразить, что похожая ситуация складывается и при анализе ДНК, но в отличие от ДНК белки невозможно наработать

входе полимеразной цепной реакции (ПЦР). А ведь именно ПЦР - основа всех методов работы с генетическим материалом, поскольку позволяет избирательно поднять концентрацию определенной молекулы ДНК до уровня, который может быть зарегистрирован приборами. Следовательно, методической основой протеомики является подход, при котором чувствительность приборов позволяет регистрировать отдельные молекулы.

Существует международный проект "Протеом человека" (аналог проекта "Геном человека") который планирует конструирование протеомной карты всех белков человека. Первоочередные задачи проекта "Протеом человека" - составление протеомных карт плазмы крови, печени и мозга. Кроме того, специальный комитет в составе проекта рассматривает новые технологические инициативы. Российский центр проекта принимает участие в разработке протеомной карты плазмы крови и печени, активно развивает новые подходы в области нанотехнологий.

Схема проведения протеомного анализа проста и основана на достижениях современной масс-спектрометрии. Образец, например плазма крови, отбирается у пациента в количестве чуть более 1 мл.. Очевидно, что в плазме крови присутствует множество различных белков. Разделение белков проводится методом двумерного электрофореза, и на двумерной электрофоре-грамме каждый белок предстает в виде отдельного пятна. Его интенсивность соответствует уровню экспрессии белка, то есть его количеству. Анализ гелей позволяет выявить индивидуальные вариации протеома, оценить статистические параметры для каждого пятна. Затем, сравнивая электрофореграмму с эталонными, удается выявить различия, связанные с заболеваниями. Различия заключаются в повышении или понижении экспрессии белка, некоторые белки появляются в плазме больных, тогда как другие могут исчезнуть. Однако на этапе анализа двумерных электрофореграмм речь на самом деле еще не идет о конкретных белках, а только об интенсивности пятен. Для того чтобы определить (идентифицировать) белок, пятно вырезают из геля, подвергают расщеплению, и массы фрагментов (пептидов) детектируют с помощью массспектрометрии.

Протеомный анализ сопряжен с проведением ряда трудоемких рутинных процедур, связанных с тем, что число анализируемых белков велико, а для статистической