РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

водородных связей. Важная особенность вторичных структур: стабилизация за счет водородных связей между пептидными амидными и карбонильными группами (однако определенный вклад вносят и ковалентные связи – пептидные и дисульфидные).

Врезультате совокупности действия таких факторов, как:

-плоское строение пептидной связи;

-возможность свободного вращения связей у Сα-углеродного атома

-постоянство углов и межатомных расстояний

формируются следующие типы вторичной структуры белков: α-спираль, β-структура и β-складка.

Третичная структура (3D-структура) – пространственная структура белка – способ укладки цепи в определенном объеме. Характеризуется наличием биологической активности. Основной движущей силой формирования третичной структуры белка является взаимодействие радикалов аминокислот с молекулами воды. При этом гидрофобные радикалы втягиваются внутрь белковой молекулы, образуя там гидрофобную зону (гидрофобный карман), а гидрофильные радикалы ориентируются в сторону растворителя – воды.

Ограничение подвижности и тем самым формирование и поддержание третичной структуры возникает также за счёт общего вклада слабых нековалентных взаимодействий (водородные, электростатические взаимодействия заряженных групп, межмолекулярные ван-дер-ваальсовы силы, гидрофобные взаимодействия и т.д.). Ковалентные – дисульфидные (-S – S-), сложноэфирные (между остатками глутаминовой и аспарагиновой кислот, с одной стороны, и оксиаминокислотами – с другой) и простые эфирные (например, между остатками серина);

Процесс формирование нативной пространственной структуры полипептидной цепи называют фолдингом (он может быть самопроизвольным, регулироваться ферментами или белками-шаперонами).

При образовании третичной структуры происходит формирование участков связывания молекулы белка с ЛИГАНДАМИ – соединениями, с которыми избирательно взаимодействует данный белок. Эти участки белковой молекулы получили название САЙТОВ, или АКТИВНЫХ ЦЕНТРОВ (у белков – ферментов).

Четвертичная структура – взаимная пространственная ориентация комплекса белков либо нескольких независимо сфолдингованных для эффективного выполнения специфической функции белка.

Олигомер – белковая молекула, состоящая из нескольких полипептидных цепей

Протомер (субъединица) – каждая входящая в олигомер цепь – протомером.

Взаимное расположение субъединиц, т.е. способ их совместной укладки и упаковки с образованием нативной конформации олигомерного белка – четвертичная структура.

Четвертичной структурой обладает около 5% белков, в том числе гемоглобин, иммуноглобулины. Субъединичное строение свойственно многим ферментам. В стабилизации четвертичной структуры принимают участие те же типы взаимодействий, что и в стабилизации третичной. Субъединицы связаны друг с другом посредством лишь слабых нековалентных взаимодействий (ионных, водородных, гидрофобных). Причем субъединицы взаимодействуют друг с другом только определенными участками своей поверхности (контактные участки).

Элементы вторичной структуры белков. Выделяют несколько основных структур, которые принимает полипептидная цепь: альфа-спираль, бета-листы, повороты и неупорядоченные петли.

Альфа-спираль представляет собой правозакрученный участок полипептида с шагом 3,6 аминокислотных остатка. Спирали включают в себя в среднем 12 аминокислот, но бывают и до 50. Структура возникает благодаря образованию водородных связей вдоль ее оси – все карбонильные группы обращены к C-концу, а NH-группы – к N-концу, навстречу карбонильным. Вордородные связи как бы сшивают спираль и не дают ей раскручиваться. Боковые радикалы аминокислот никак не участвуют в образовании спирали и обращены наружу.

Бета-листы (слои) образуются межу двумя расположенными рядом полипептидными цепями и стабилизируются водородными связями между карбонильными и NHгруппами соседних цепей. Бывают параллельные и антипараллельные (являются более стабильными, т.к. в этом случае водородные связи располагаются почти перпендикулярно пептидным, поэтому имеют меньшую длину). В пространстве представляет собой складчатые слои. Боковые радикалы ориентированы вне плоскости листа. образовании β-листов принимают участие все пептидные связи, т. е. создается довольно плотная сеть водородных связей, что придает структуре высокую стабильность.

Бета-поворот встречается на участках с пролином, боковой радикал которого очень жесткий. Поворот дополнительно фиксируется водородной связью глицинового остатка. В результате полипептидная цепь поворачивается на 180Г.

Некоторые элементы не упорядочены – это петли, повороты основной цепи и линкеры (находятся между упорядоченными элементами), неупорядоченные клубки.

Существуют супервторичные структуры – мотивы:

•Повторяющиеся антипараллельные бета-листы – меандры

•Повторяющиеся бета- и альфа-элементы – бета-альфа-бета-мотив

•Укладка из 4-х бета-листов – греческий ключ

Билет 27.

1. Структура мРНК. Альтернативный сплайсинг и полиморфизм белков. Матричная РНК синтезируется в ядре клетки, и ее уникальная первичная

последовательность является шаблоном (матрицей) для синтеза белка, закодированного в гене (соответствующем фрагменте ДНК).

Моноцистронная мРНК – содержит информацию, необходимую для трансляции только одного белка (один цистрон).

Полицистронная мРНК кодирует несколько белков. Гены (цистроны) в такой мРНК разделены интергенными, некодирующими последовательностями.

Структура: На 5'-конце всех мРНК присутствует модифицированный нуклеотид 7- метилгуанозин-5'-трифосфат (кэп). Он добавляется на 5'- (передний) конец незрелой мРНК. Эта модификация очень важна для узнавания мРНК при инициации трансляции, а также для защиты от 5'-нуклеаз — ферментов, разрушающих цепи нуклеиновых кислот с незащищённым 5'-концом.

Старт – кодон: Через несколько десятков нуклеотидов от кэпа находится инициирующий кодон – триплет AUG, кодирующий аминокислоту метионин.

Кодирующий участок – состоят из кодонов — следующих непосредственно друг за другом последовательностей из трёх нуклеотидов, каждая из которых соответствует в генетическом коде определённой аминокислоте или началу и концу синтеза белка. В дополнение к кодированию белков, части кодирующих областей могут служить управляющими последовательностями. Например, вторичная структура РНК в некоторых случаях определяет результат трансляции.

Терминирующий (стоп) кодон: UGA, UUA или UAG.

На 3'-конце эукариот присутствует последовательность нуклеотидов из 100–200 аденозинфосфатных остатков – поли(А)-фрагмент. Эту последовательность используют при выделении мРНК с помощью аффинной хроматографии на колонке, заполненной сорбентом с политимидиновыми (поли-Т) олигонуклеотидами, иммобилизованными на его поверхности.

+ Нетранслируемые области — участки РНК, расположенные до старт-кодона и после стоп-кодона, которые не кодируют белок. Они называются 5'-нетранслируемая область и 3'-нетранслируемая область, соответственно. Эти области транскрибируются в составе того же самого транскрипта, что и кодирующий участок. Функции: регуляция стабильности мРНК, локализация мРНК и эффективность трансляции. Стабильность мРНК может контролироваться 5'- и/или 3'-областью из-за различной

чувствительности к ферментам, которые отвечают за деградацию РНК — РНКазам и регуляторным белкам, которые убыстряют или замедляют деградацию.

Альтернативный сплайсинг— вариант сплайсинга матричных РНК (мРНК), при котором в ходе экспрессии гена на основе одного и того же первичного транскрипта (пре-мРНК) происходит образование нескольких зрелых мРНК.

Структурные и функциональные различия образовавшихся транскриптов могут быть вызваны как выборочным включением в зрелую мРНК экзонов первичного транскрипта, так и сохранением в ней частей интронов. Наиболее распространённая разновидность : экзоны транскрипта при определённых условиях могут быть как включены в зрелую мРНК, так и пропущены.

Белки, получаемые трансляцией таких мРНК, в результате имеют разные аминокислотные последовательности; таким образом, при альтернативном сплайсинге один транскрипт обеспечивает синтез нескольких белков. Широкое распространение такого сплайсинга у эукариот приводит к значительному увеличению разнообразия белков, закодированных в их геномах. У человека белков 105 тысяч –а генов 20 тыс.

Факторы сплайсинга:

•Активаторы - способствуют использованию отдельных его сайтов

•Репрессоры - предотвращают их использование

Полиморфизм белков — существование разных форм белка, выполняющего одинаковые или очень сходные функции (изобелки). Чаще всего изучают полиморфизм ферментов (т. е. наличие изоферментов), поскольку их гораздо легче обнаружить, чем другие белки, по катализируемой ими реакции.

Источники полиморфизма:

Различают 2 вида полиморфизма:

•Наследственный полиморфизм создаётся мутациями и комбинативной изменчивостью.

•Адаптационный полиморфизм обусловлен тем, что естественный отбор благоприятствует разным генотипам из-за разнообразия условий среды в пределах ареала вида или сезонной смены условий.

Трансплантационная несовместимость. От полиморфизма белков в сочетании с иммунологическими реакциями зависит трансплантационная несовместимость. Клетки трансплантата содержат аллельные варианты белков, отличающиеся от вариантов реципиента. Эти белки донора являются антигенами для организма реципиента и приводят к развитию реакции клеточного иммунитета, в результате которой трансплан­тированная ткань отторгается.

Отторжение трансплантата в наибольшей мере определяется главным комплексом тканевой совместимости — так называют участок генома, содержащий небольшое число структурных генов (не меньше трех), и белки, кодируемые этими генами. Гены главного комплекса тканевой совместимости отличаются необычайно высоким полиморфизмом: число комбинаций разных аллелей по генам этой системы дости­гает нескольких миллионов. Это самая полиморфная система человека из всех известных в настоящее время. Высокая степень полиморфизма генов обеспечивает столь же высокую степень ин­дивидуальности по белкам, которые кодируются этими генами. Подбор донора и реципиента, сходных по антигенным свойствам белков главного комплекса совместимости, значительно повыша­ет вероятность приживления трансплантата.

Полиморфизм белков был первым поколением маркеров, используемых для генетических исследований домашних животных. Однако количество полиморфных локусов, доступных для анализа, и уровень их наблюдаемого полиморфизма часто низки, что сильно ограничивает их применение в исследованиях генетического разнообразия.

Белки ортологи – это гомологичные белки разных организмов, разошедшиеся в процессе видообразования и обычно выполняющие одну и ту же функцию

Парологи – гомологичные белки одного организма, возникающие в результате дупликации гена и могут разойтись в процессе эволюции так, что начнут выполнять различные функции.

2. Прионы. Механизм развития прионных заболеваний.

Прионы — особый класс инфекционных патогенов, представленных белками с аномальной третичной структурой, не содержащими нуклеиновые кислоты. Это единственные известные инфекционные агенты, размножение которых происходит без участия нуклеиновых кислот.

Прион способен катализировать конформационное превращение гомологичного ему нормального клеточного белка в себе подобный (прион). Как правило, при переходе белка в прионное состояние его α-спирали превращаются в β-слои. Появившиеся в результате такого перехода прионы могут в свою очередь перестраивать новые молекулы белка; таким образом, запускается цепная реакция, в ходе которой образуется огромное количество неправильно свёрнутых молекул. На месте погибшей клетки образуется пустота — вакуоль, заполненная жидкостью. С течением времени будет исчезать один нейрон за другим, а в мозге — образовываться всё больше «дыр», пока, наконец, мозг не превратится в губку, за чем неминуемо последует смерть.

Все известные прионы вызывают формирование амилоидов — белковых агрегатов, включающих плотно упакованные β-слои. Амилоиды представляют собой фибриллы, растущие на концах, а разлом фибриллы приводит к появлению четырёх растущих концов. Инкубационный период прионного заболевания определяется скоростью экспоненциального роста количества прионов, а она, в свою очередь, зависит от скорости линейного роста и фрагментации агрегатов (фибрилл). Для размножения приона необходимо исходное наличие нормально уложенного клеточного прионного белка; организмы, у которых отсутствует нормальная форма прионного белка, не страдают прионными заболеваниями.

Прионная форма белка чрезвычайно стабильна и накапливается в поражённой ткани, вызывая её повреждение и, в конечном счёте, отмирание. Стабильность прионной формы означает, что прионы устойчивы к денатурации под действием химических и физических агентов, поэтому уничтожить эти частицы или сдержать их рост тяжело.

Заболевания — трансмиссивные губчатые энцефалопатии (ТГЭ) у различных млекопитающих, фатальную семейную бессонницу и куру. Все известные прионные заболевания поражают головной мозг и другие нервные ткани, в настоящее время неизлечимы и в конечном итоге смертельны.

Пути передач: наследственный (за счёт мутаций в гене, кодирующего белок) и инфекционный. То есть внедрение приона может произойти неожиданно — например, при употреблении в пищу недостаточно хорошо прожаренного или сваренного мяса (в котором должна присутствовать форма PrPSc), при переливании крови, при трансплантации органов и тканей, при введении гормонов гипофиза животного происхождения.

Билет 28.

1.Генотипирование организмов для идентификации и определения степени родства. Молекулярная диагностика заболеваний.

Генотипирование организма – процесс определения генотипа организма.

Исследование осуществляется в три этапа:

1.Выделение ДНК из биологического материала.

2.Увеличение количества исследуемых локусов ДНК для дальнейшего анализа методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР);

3.Анализ полиморфизмов длин фрагментов, полученных после ПЦР (выявление коротких тандемных повторов), с помощью капиллярного электрофореза и/или определение первичной последовательности нуклеотидов амплифицированных

локусов (выявление однонуклеотидных полиморфизмов) методом секвенирования.

Точность экспертизы зависит от степени родства, количества родственников, принимающих участие в исследовании, и количества анализируемых маркеров (рекомендуется тестировать более двух лиц, предположительно находящихся в родстве).

Генетическими маркерами, исследуемыми в ходе генетической экспертизы по установлению близкого родства, могут выступать:

•Аутосомные локусы. Аутосомы – все хромосомы, кроме половых (X- и Y- хромосом). Генетические маркеры, расположенные на аутосомах (аутосомные локусы), наиболее часто используются в генетической экспертизе по установлению близкого родства.

•STR-локусы (микросателлитные) Y-хромосомы. Это непарная хромосома,

поэтому в мейозе не рекомбинирует и, следовательно, передается по наследству от отца сыну в практически неизменном виде.

•STR-локусы X-хромосомы. В женских клетках находятся две X-хромосомы, в то время как в мужских - только одна. Поэтому в мужских клетках X-хромосома практически не рекомбинирует и передается детям в практически неизменном виде.

•нуклеотидный профиль митохондриальной ДНК (мтДНК).

Протеомная карта какой либо ткани/клетки – количественный и качественный набор белков ткани/клетки, отображает какие белки и сколько их есть в исследуемом образце.

Протеомная карта заболевания – это понимание развития клинической картины заболевания в виде количественных и качественных нарушений на геномном, транскрипционном, трансляционном и посттрансялционном уровнях функционирования организма, т.е. на уровне нарушений в составе и взаимодействии

генов в ДНК, РНК, белков, липидов, углеводов, а также на уровне образующихся в клетке и взаимодействующих между собой метаболитов.

Важно подчеркнуть, что наличие подобных нарушений часто указывает лишь на вероятность развития патологии, следовательно можно, повлияв на факторы внешней среды, снизить вероятность развития заболевания, если провести соответствующие индивидуальные профилактические мероприятия.

Молекулярная (протеомная) диагностика является достоверным инструментом диагностики ранних стадий онкологических заболеваний и конкретно диагностики "молчащих раков", не проявляющих себя до тех пор, пока лечить его не станет поздно. Традиционные методики верификации рака подразумевают проведение биопсии, то есть забора микропорции ткани. Альтернатива – протеомная диагностика.

В глобальном масштабе протеомика занимается инвентаризацией всех белков организма.

Медицинский аспект проблемы - установить корреляцию между набором белков и началом или развитием болезни. Задача сходна с геномикой, где определяется зависимость между болезнью и геномом, но на порядок сложнее. Дело в том, что белков намного больше, чем генов. Число последних оценивается в 30-40 тыс., однако каждый ген может считываться во множестве (до 200) альтернативных вариантов, а значит, белков может быть значительно больше - до 6-8 млн. в одной клетке. Причем конкретный белок может быть экспрессирован как в виде единичных молекулярных копий, так и в огромном количестве - налицо широкий диапазон концентраций белков

вклетке и биологических жидкостях. Можно возразить, что похожая ситуация складывается и при анализе ДНК, но в отличие от ДНК белки невозможно наработать

входе полимеразной цепной реакции (ПЦР). А ведь именно ПЦР - основа всех методов работы с генетическим материалом, поскольку позволяет избирательно поднять концентрацию определенной молекулы ДНК до уровня, который может быть зарегистрирован приборами. Следовательно, методической основой протеомики является подход, при котором чувствительность приборов позволяет регистрировать отдельные молекулы.

Существует международный проект "Протеом человека" (аналог проекта "Геном человека") который планирует конструирование протеомной карты всех белков человека. Первоочередные задачи проекта "Протеом человека" - составление протеомных карт плазмы крови, печени и мозга. Кроме того, специальный комитет в составе проекта рассматривает новые технологические инициативы. Российский центр проекта принимает участие в разработке протеомной карты плазмы крови и печени, активно развивает новые подходы в области нанотехнологий.

Схема проведения протеомного анализа проста и основана на достижениях современной масс-спектрометрии. Образец, например плазма крови, отбирается у пациента в количестве чуть более 1 мл.. Очевидно, что в плазме крови присутствует множество различных белков. Разделение белков проводится методом двумерного электрофореза, и на двумерной электрофоре-грамме каждый белок предстает в виде отдельного пятна. Его интенсивность соответствует уровню экспрессии белка, то есть его количеству. Анализ гелей позволяет выявить индивидуальные вариации протеома, оценить статистические параметры для каждого пятна. Затем, сравнивая электрофореграмму с эталонными, удается выявить различия, связанные с заболеваниями. Различия заключаются в повышении или понижении экспрессии белка, некоторые белки появляются в плазме больных, тогда как другие могут исчезнуть. Однако на этапе анализа двумерных электрофореграмм речь на самом деле еще не идет о конкретных белках, а только об интенсивности пятен. Для того чтобы определить (идентифицировать) белок, пятно вырезают из геля, подвергают расщеплению, и массы фрагментов (пептидов) детектируют с помощью массспектрометрии.

Протеомный анализ сопряжен с проведением ряда трудоемких рутинных процедур, связанных с тем, что число анализируемых белков велико, а для статистической значимости результата требуется обработать большое количество образцов в соответствии со стандартным протоколом. Снятые масс-спектры передаются в программу идентификации белков. Профиль масс, полученный на масс-спектрометре, соответствующий пептидным фрагментам белка, позволяет однозначно его идентифицировать, проведя поиск соответствия с теоретическими профилями, построенными по белкам человеческого генома через специализированные компьютерные базы данных в сети Интернет в онлайн-режиме.

Для врача молекулярная карта заболевания – это ключ к точному диагнозу, прогнозу и целенаправленной терапии болезни. Для исследователя молекулярная карта заболевания – базис для новых открытий.

Если получить протеомные карты нормальных и патологических тканей, то по различиям в них можно установить, какие белки важны для развития того или иного патологического состояния, и выбрать их в качестве мишеней или использовать эти знания для диагностики. Можно предположить, что в будущем к обычному анализу крови добавится создание протеомных карт крови. Для этого в поликлиниках необходимо будет использовать специальное оборудование, с помощью которого у пациентов периодически будут брать кровь. При возникновении болезненного состояния протеомную карту больного человека нужно будет всего лишь сравнить с его же протеомной картой, но составленной в то время, когда он был здоров, и можно

будет выявить произошедшие изменения в белковом составе крови и определить причину заболевания. Подобное сравнение протеомов опухолевых и нормальных клеток, клеток до и после воздействия определенных факторов (например, физических или химических), использование биологических жидкостей в диагностических целях – все это представляет огромный интерес и открывает совершенно новые перспективы для медицины, ветеринарии, фармакологии, пищевой промышленности и других прикладных областей.

Что можно получить:

•дешевые и доступные каждому методы медицинской диагностики, которые позволяют определять самые ранние стадии развития заболеваний.

•индивидуальные методы лечения заболеваний, которые в настоящее время считаются неизлечимыми.

•создание новых методов биоинформатики и новых технологий, позволяющим исследователям работать в низких концентрациях.

2. Ионообменная хроматография для разделения и очистки белков. Хроматография – метод разделения и определения веществ, основанный на

распределении компонентов между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Неподвижная фаза – твердое пористое вещество, которое называется сорбентов или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза – жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

Компоненты анализируемой смеси вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Неподвижная – обычно в трубе – колонке. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента компоненты будут перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степени взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут ее вместе с подвижной фазой.

Достоинства хроматографии:

6.Разделение носит динамический характер, акты сорбции-десорбции повторяются многократно – это эффективно

7.При разделении используют различные типы взаимодействия сорбатов и неподвижной фазы: от чисто физических до хемосорбционных – возможность селективного разделения широкого круга веществ.

8.На разделяемые вещества можно накладывать различные дополнительные поля (гравитационное, магнитное и тд), которые расширяют возможности разделения

9.Это гибридный метод, сочетающий одновременно и разделение, и определение нескольких веществ.