РАЗОБРАННЫЕ БИЛЕТЫ

В случае низкой гомологии часто используют методики поиска по профилям последовательностей, в которых для «запроса» к базе последовательностей используется не одиночная последовательность, а профиль, сконструированный на основе множественного выравнивания — своеобразная метапоследовательность, кодирующая в себе эволюционную вариабельность данного белка. С помощью этой методики иногда удаётся «вычислить» пригодный для моделирования структурный шаблон, несмотря на то, что идентичность последовательностей с ним составляет лишь 10–15%.

Область применения предсказанных структур белков довольно разнообразна, и они оказываются полезными на различных этапах процесса разработки фармацевтических препаратов.

Билет 12.

1.Проекты по созданию искусственной жизни: бактерия Синтия и эукариотический организм «Синтетические дрожжи». Значение и перспективы

применения.

Создание искусственного генома — направление в биологических исследованиях, связанное с генетической модификацией существующих организмов с целью создания организмов с новыми свойствами. В отличие от генной инженерии, искусственный геном состоит из генов, синтезированных химическим путём.

Перспективы: предполагается, что в перспективе могут быть созданы искусственные геномы не на основе ДНК или с использованием другого набора нуклеотидов и других принципов кодирования, чем в естественных геномах.

Пример возможного использования:

1) создать микроводоросли, которые будут захватывать атмосферный диоксид углерода гораздо эффективнее, чем существующие в природе. В свою очередь, именно микроводоросли считаются наиболее перспективным источником биотоплив. 2) модификация генома бактерий для создания эффективных и безвредных вакцин против новых штаммов гриппа в течение часов, а не месяцев. Создание такой технологии смогло бы победить главное преимущество вируса гриппа — его потрясающую изменчивость.

При этом следует понимать, что пока речь идет о синтезе генов с естественными генетическими кодами или их небольшими модификациями. Можно синтезировать искусственный ген, кодирующий любой наперед заданный полипептид, но при этом пока невозможно спроектировать принципиально новый полипептид так, чтобы он хотя бы свернулся в белковую глобулу, не говоря уже о том, чтобы получившийся белок начал функционировать как фермент.

Внастоящее время высшим достижением в области создания искусственного генома является синтез хромосомы бактерии Mycoplasma mycoides, осуществлённый Крейгом Вентером (основатель Celera Genomics ) в 2010 году.

В2010 году удалось искусственно синтезировать циклическую хромосому бактерии Mycoplasma mycoides размером 1 077 947 нуклеотидных пар. Хромосома была имплантирована в клетку бактерии Mycoplasma capricolum, после деления которой образовалась клетка, полностью управляемая искусственным геномом.

Этот искусственный геном практически полностью повторяет геном одного из штаммов бактерии Mycoplasma mycoides, за исключением нескольких искусственно внедрённых генетических маркеров, нескольких удалённых в процессе синтеза незначимых генов и 19 мутаций, возникших в процессе сборки фрагментов ДНК. Клетки с искусственным геномом нормально функционируют и способны к многократным делениям.

Mycoplasma labratorium или Synthia относится к синтетическим видам бактерий.

Цель: сократить живой организм до самого необходимого и, таким образом, понять, что требуется для создания нового организма с нуля.

За основу взят геном эубактерии Mycoplasma mycoides, собранный сначала в компьютере, а затем искусственно синтезированный (1,1 млн по). Геном клонирован в дрожжах, затем внедрен в мембранную структуру из клеток другого рода микоплазм

Mycoplasma capricolum.

Чтобы идентифицировать минимальные гены, необходимые для жизни, каждый из 482 генов был индивидуально удален, и была проверена жизнеспособность полученных мутантов. Это привело к идентификации минимального набора из 382 генов, который теоретически должен представлять минимальный геном. Единственная ДНК в клетках - это разработанная синтетическая последовательность ДНК, включая последовательности «водяных знаков» и другие спроектированные делеции и полиморфизмы генов, а также мутации, приобретенные в процессе построения.

В2008 г. в лаборатории был сконструирован полный набор генов с добавлением водяных знаков для идентификации генов как синтетических.

В2010 году полный геном M. mycoides был успешно синтезирован из компьютерной записи и трансплантирован в существующую клетку Mycoplasma capricolum, у которой была удалена ДНК. Новая бактерия могла расти и получила название Synthia.

В2016 году Институт Вентера использовал гены из JCVI-syn1.0 для синтеза меньшего генома, который они назвали JCVI-syn3.0, который содержит 531 560 пар оснований и 473 гена. В этом новом организме количество генов можно сократить только до 473, 149 из которых имеют совершенно неизвестные функции.

В2019 году была опубликована полная вычислительная модель всех путей в клетке Syn3.0, представляющая первую полную модель in silico для живого минимального организма.

«Синтетические дрожжи»

Задача: полный синтез генома пекарских дрожжей, — а в нем умещается почти вдесятеро больше генов, чем в минимизированной версии микоплазмы.

Выбор именно дрожжей в качестве цели проекта:

1)из всех ядерных организмов у них один из самых маленьких геномов

2)это хорошо изученная и удобная для манипуляций модельная система

3)важность дрожжей для экономики сложно сопоставить с каким-либо другим микроорганизмом.

4)организация генома, возможности синтеза белков и вообще строение клетки у

бактерий и эукариот очень существенно отличаются.

Фундамент исследования тот же, что и у микоплазмы — химический синтез олигонуклеотидов.

Работы по созданию «искусственных дрожжей» в проекте Sc2.0 разбиты среди исследовательских центров по отдельным хромосомам.

Поэтому в недавно секвенированных геномах белки обычно аннотируют по аналогии с последовательностями схожих белков из других геномов. Однако не всегда близкородственные белки выполняют одну и ту же функцию, например, дрожжевые белки Gal1 и Gal3 являются паралогами с 73 % и 92 % сходства, приобретшие в ходе эволюции очень разные функции: так, Gal1 является галактокиназой, а Gal3 — индуктором транскрипции.

Моделирование на основании гомологии.

1.Идентификация структурного шаблона — белка с известной пространственной структурой, гомологичного моделируемому (идентичность последовательностей >30%). Поиск производится с помощью серверов FASTA или PSI-BLAST (или их аналогов) в базе структур белков PDB (едином депозитарии структурных данных для биомакромолекул);

2.Построение выравнивания аминокислотных последовательностей шаблон-

модель.

Парное выравнивание служит «инструкцией» программам, осуществляющим моделирование.

Множественное выравнивание может быть полезно для выявления консервативных остатков во всём семействе (показаны звёздочкой) или отдельных подсемействах белков (три верхних последовательности — рецепторы мелатонина). Множественное выравнивание и профили последовательностей позволяют идентифицировать более слабые гомологии, чем «обыкновенное» парное выравнивание. Выравнивание проводят с помощью сервера CLUSTALW (или его аналогов);

3.Построение модели заключается, главным образом, в «натягивании» последовательности моделируемого белка (рецептора мелатонина MT1) на «остов» шаблона (зрительного родопсина) согласно выравниванию. «Петлевые» участки (не имеющие гомологии с шаблоном) достраиваются независимо, положение боковых цепей оптимизируется с помощью методов эмпирических силовых полей. В первом трансмембранном сегменте наложенных структур модели и шаблона показаны боковые цепи остатков, «подсвеченных» на выравнивании. Моделирование проводят с помощью программы Modeller (и аналогичных ей) или сервера Swiss-Model (и ему подобных). В онлайн-базах ModBase и Swiss-Model Repositoryсодержатся автоматически построенные модели для всех белков из базы Swiss-Prot, для которых удаётся найти

метапоследовательность, кодирующая в себе эволюционную вариабельность данного белка. С помощью этой методики иногда удаётся «вычислить» пригодный для моделирования структурный шаблон, несмотря на то, что идентичность последовательностей с ним составляет лишь 10–15%.

Область применения предсказанных структур белков довольно разнообразна, и они оказываются полезными на различных этапах процесса разработки фармацевтических препаратов.

Элаймент или выравнивание последовательностей — базовый биоинформатический метод, основанный на размещении несольких последовательностей ДНК, РНК или белков друг под другом таким образом, что можно легко определить сходные/различающиеся участки в этих последовательностях. То есть выравнивание — это определение соответствия между аминокислотными остатками (для белков) и нуклеотидами (для НК).

Множественное выравнивание – метод, использующий для сравнение более двух последовательностей.

Методы множественного выравнивания пытаются выровнять все последовательности в заданном наборе запросов. Множественные выравнивания часто используются для идентификации областей консервативных последовательностей в группе последовательностей, предположительно связанных эволюционно. Такие консервативные мотивы последовательности могут быть использованы в сочетании со структурной и механистической информации, чтобы определить местонахождение каталитические активные центры из ферментов . Выравнивания также используются для помощи в установлении эволюционных отношений путем построения филогенетических деревьев .

Консервативные последовательности — схожие или идентичные последовательности, встречающиеся в биологических полимерах. Консервативность белковой последовательности можно определить по наличию одинаковых аминокислот в аналогичных частях белков. Консервативность же белковой структуры определяется наличием функционально эквивалентных, но не обязательно одинаковых аминокислот в аналогичных частях белков.

Билет 13.

1.Основные методы секвенирования небольших фрагментов ДНК: химический и ферментативный. Автоматизация секвенирования коротких ДНК.

Секвенирование – это метод определения последовательности ДНК. В результате секвенирования получают формальное описание первичной структуры линейной макромолекулы в виде последовательности мономеров в текстовом виде (1977 г. – Максам и Гилберт).

Химическое секвенирование (химическая деградация).

Суть: проведение гидролиза (химическая реакция взаимодействия вещества с водой, при которой происходит разложение этого вещества и воды с образованием новых соединений) олигонуклеотида различными специфичными химическими реагентами и последующего анализа полученных фрагментов с помощью электрофореза в ПААГ с последующей авторадиографией.

Этапы:

1.Рестрикция и выделение фрагмента

2.Мечение 5’-конца радиоактивной меткой (радиоактивный остаток фосфорной кислоты)

3.Образец делят на 4 порции и в каждую пробирку добавляют разные химические реагенты:

1)По гуанозиновым звеньям (Г) молекула расщепляется под действием диметилсульфата ((CH3)SO4, метилирование)

2)По пуриновым (А+Г) основаниям молекула расщепляется под действием муравьиной кислоты (HCOOH)

3)По пиримидиновым (Т+С) основаниям молекула расщепляется под действием гидразина (NH2NH2)

4)По цитидинам молекула расщепляется по цитидинам (С) под действием гидразина в присутствии NaCl.

4.Все четыре реакционные смеси вносят в лунки геля и проводят электрофорез – полосы фрагментов с радиоактивной меткой проявляются с помощью фотобумаги).

5.«Сборка» молекулы с самого короткого фрагмента (того, что имеет самый большой пробег на картинке фореза), в результате восстанавливается вся последовательность исходного олигонуклеотида.

Обязательное условие: наличие фрагмента ДНК, меченного только по одному концу.

Ограничения метода химического секвенирования:

1)Трудоемкость

2)Токсичность реагентов

3)Малый размер фрагментов для определения (сейчас применяется для фрагментов ДНК длиной в 10-100 пар оснований)

Ферментативное секвенирование («по Сенгеру», метод обрыва цепи, метод дидезокситерминаторов).

В основе метода: способность ДНК-полимеразы синтезировать новую цепь нуклеотида, соответствующую (комплиментарную) материнской цепи.

Действие ДНК-полимеразы: это ключевой фермент при репликации ДНК. Этот фермент, «двигаясь» по одноцепочечной молекуле ДНК, катализирует образование фосфодиэфирных связей, между 3'-гидроксилом предыдущего нуклеозида и 5'- фосфатной группой следующего (рис. 2.15). То есть рост новой цепи, комплементарной материнской, происходит в направлении от 5' к 3'-концу. В качестве «строительного материала» используются 5'-нуклеозидтрифосфаты ТТP, АТP, GТP и СТP. Скорость синтеза комплементарного полимера велика, (например, у прокариот она составляет 1 000 н.о. в секунду).

Суть:

1)В реакционную смесь вносят все необходимые компоненты ПЦР

2)Затем делят ее на 4 части и в каждую дополнительно вносят один из дидезоксинуклеозидтрифосфатов

*дидезоксирибонуклеозидтрифосфат ddNTP – нуклеозидтрифосфат без 3'-

гидроксильной группы (являются терминаторами реакции).

3)Каждый раз, когда при синтезе межнуклеотидной связи в цепь включается такой остаток, реакция останавливается (происходит обрыв цепи) – следующее звено не может присоединиться, поскольку 3'-ОН отсутствует.

4)В пробирке с ddATP накапливаются олигонуклеотиды разной длины, каждый из которых оканчивается на аденозин, в пробирке с ddСТP – на цитидин, в пробирке с ddGТP – на гуанозин, а с ddTTP – на тимидин (в общем оканчивается на тот, который вносили в пробирку).

5)Реакционные смеси анализируют с помощью гель-электрофореза в денатурирующих условиях (в зависимости от размера олигонуклеотидыпродукты ПЦР двигаются в геле с разной скоростью).

6)Полученную картинку проявляют радиоавтографией. Для этого продукты метят изотопной меткой, используя в реакционной смеси добавку радиоактивно-

меченного 32Р АТР.

Недостатки метода ферментативного секвенирования: получение одноцепочечной матрицы (до ПЦР), трудоемкость чтения результата, размер до ~800 нуклеотидов.

Преимущества метода: высокая точность (достоверность) полученных данных и невысокая стоимость работ при анализе небольшого количества ДНК-фрагментов

Применение секвенирования по Сенгеру:

•секвенирование отдельных участков генома с целью анализа мутаций и полиморфизмов;

•идентификация вирусов и организмов (бактерий, растений, грибов и животных);

•валидация данных, полученных на платформах секвенирования нового поколения (NGS);

•микросателлитный анализ – анализ коротких тандемных повторов используют для получения «генетического паспорта» личности. микросаттелиты – варьирующие участки в ядерной ДНК и ДНК органелл, состоящие из тандемно повторяющихся мономеров длиной меньше 9 пар оснований и образующие поля менее 1 тысячи пар оснований;

• анализ делеций и инсерций (малых и протяженных).

Автоматизация чтения олигонуклеотидных последовательностей ДНК:

В настоящее время секвенирование проводят в автоматическом режиме, а для анализа используют флуоресцентные метки, которые присоединяют к молекулам дидезоксинуклеозидтрифосфатов. Каждая флуоресцентная метка имеет свой спектр свечения (окраску).

Для электрофореза используют капилляры, заполненные гелем (500-1000 нуклеотидов), либо гель по 1 или 2 дорожкам (40-1800 нуклеотидов). Свечение инициируется лазерным лучом и по цвету соотносится с соответствующим основанием. Каждая буква отражается в виде пика со своим цветом.

Секвенирование позволяет выявлять в том числе и наличие мутаций:

Например, образец имеет гетерозиготный генотип, когда в аллелях на одном и том же месте находятся разные нуклеотиды C и T. Такая мутация называется однонуклеотидным полиморфизмом.

2. Аффинная очистка белков, основной принцип и примеры.

Хроматография – метод разделения и определения веществ, основанный на распределении компонентов между двумя фазами – подвижной и неподвижной. Неподвижная фаза – твердое пористое вещество, которое называется сорбентов или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза – жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

Компоненты анализируемой смеси вместе с подвижной фазой передвигаются вдоль стационарной фазы. Неподвижная – обычно в трубе – колонке. В зависимости от силы взаимодействия с поверхностью сорбента компоненты будут перемещаться вдоль колонки с разной скоростью. Одни компоненты останутся в верхнем слое сорбента, другие, в меньшей степени взаимодействующие с сорбентом, окажутся в нижней части колонки, а некоторые и вовсе покинут ее вместе с подвижной фазой.

Достоинства хроматографии:

1.Разделение носит динамический характер, акты сорбции-десорбции повторяются многократно – это эффективно

2.При разделении используют различные типы взаимодействия сорбатов и неподвижной фазы: от чисто физических до хемосорбционных – возможность селективного разделения широкого круга веществ.

3.На разделяемые вещества можно накладывать различные дополнительные поля (гравитационное, магнитное и тд), которые расширяют возможности разделения

4.Это гибридный метод, сочетающий одновременно и разделение, и определение нескольких веществ.