5. Каллусты жасушаларды алу, өсіру және сипаттамасы.

Каллус ұлпасы жасуша өсіндісінде жоғары сатыдағы өсімдіктерде кездесетін жасушалардыѕ мамандану қабілетініѕ жойылуына байланысты пайда болады. Каллус ұлпасы өте сирек жағдайда, өсімдік зақымданғанда пайда болады. Бұл ұлпа зақымданған жерді қорғап, мүшені қалпына келтіру үшін қоректік заттарды сол жерге жинайды. Арнайы ұлпа жасушаларыныѕ бөлінуге қабілеті пайда болған кезде каллус ұлпасы түзіледі.

Жасуша зақымданғанда оныѕ жауабы ретінде төзімділік пайда болады. Қоректік ортаға кез келген ұлпаныѕ бөлігін немесе эксплантты енгізгенде де, каллустыѕ түзілуін байқауға болады. Эксплант дегеніміз – каллус ұлпасын алу үшін қоректік ортаға отырғызылатын өсімдіктіѕ алғашқы бір бөлшегі.

Бірақ эксплант құрамында физиологиялық белсенді заттар аз болғандықтан каллус ұлпасы пайда болуы үшін қоректік ортаға қоздырғыш ретінде фитогормондарды қосады.

Каллус ұлпасы тығыздылығына байланысты борпылдақ, тығыз немесе орташа тығыз болады. Борпылдақ каллус тез өседі және сұйық орта /суспензия/ дайындауға қолайлы. Тығыз каллус ұлпасын екінші мамандану арқылы тұтас өсімдік алу үшін пайдаланады.

Каллус пайда болуы үшін алғашқы кезде қоректік ортада ауксинніѕ мөлшері, оныѕ өсу кезіндегі көрсеткішінен бірнеше рет жоғары болуы шарт. Мысалы, каллустыѕ пайда болу кезінде ортаға 2-3 мг/л 2,4-D қосу қажет болса, ал оныѕ өсуін қолдау үшін 0.5- 1.5 мг/л 2,4 D жеткілікті /эксплант түріне байланысты/.

Каллус ұлпасыныѕ өсуін сақтау үшін (әрбір 4-6 аптадан соѕ) ұлпаныѕ бір бөлігін залалсыздандырылған жағдайда сақтай отырып, жаѕа қоректік ортаға ауыстырады, бұл үрдісті көшіру немесе пассаж жасау дейді. Осылай каллус ұлпасын ұзақ уақыт /оншақты жылдар бойы/ сақтауға болады. (лпаны бірнеше рет пассаждан өткізуге/ көшіруге/ болады. Бірақ көп рет пассаждан өткен каллус “үйреншікті” жағдайға ұшырайды. Нәтижесінде гормондық тәуелсіздік пайда болып, каллус ұлпасыныѕ тұтас өсімдікті қалпына келтіру қасиеті жойылып кетуі мүмкін.

Өсудіѕ жылдамдығына байланысты каллусты қайта отырғызуды /пассаждауды/ 28-30 күн сайын жүргізіп отырады. Өсіру кезеѕі орташа 4 аптаға теѕ. Каллус ұлпасыныѕ жаѕа қоректік ортаға қайта отырғызуға арналған бөлігін енді эксплант емес, оны трансплант деп атайды.

Каллус ұлпасы пайда болу үшін эксплант ретінде өсімдіктіѕ әр түрлі мүшесін: тамыр, өркен, жапырақ, тозаѕқапты және т.б қолдануға болады.

Каллус алу үшін жетілмеген, жас ұлпаларды пайдаланған жөн. Мысалы, ұрықтанудан 8-10 күн өткен соѕ алынған жүгерініѕ эндосперм эксплантынан каллус пайда болмайды.

Алғашқы экспланттыѕ өлшемі каллустыѕ өсуіне әсерін тигізбейді, бірақ еѕ аз мөлшердіѕ шегі болады, оны азайтқан жағдайда эксплантты өсіру мүмкін емес. Мысалы, сәбіз тамырыныѕ флоэмасынан алынған массасы 3,8 мг экспланттар өсуге жарамды болса, осындай мөлшерде жер алмұртынан алынған эксплант жарамсыз. Оныѕ себебі сәбіз жасушалары ұсақ болғандықтан, эксплантты кескен кезде олар көбірек зақымданады.

Каллус жасушалары өсу кезінде бөлініп, өсіп, маманданып, соѕында өсуі тежеліп, тоқтайды. Каллус ұлпасыныѕ өсуі қалыпты жасушалар сияқты S- әрпі тәрізді сызба ѕұсқасымен бейнеленеді (4-сурет). Әдетте, агарланған 20-40 мл қоректік ортаға отырғызылатын масса 60-100 мг теѕ.

Осы мөлшердегі экспланттыѕ үлкен бөлігі 3-8 апта ішінде қайта отырғызуға жеткілікті каллус түзеді. Осы каллусты әрі қарай өсірген кезде, генетикалық және физиологиялық ерекшеліктері бар жасуша штаммы түзіледі.

2. Энтомопатогенді препараттарды алу технологиясы. Нитрагин және ризотрофин бактериялық тыңайтқыштарын алу. Мәдени өсімдіктер түрлі зиянды шөптерден, кеміргіштерден, жәндіктерден, нематодалардан, фитопатогенді бактериялардан, саңырауқұлақтардан, климаттың жағымсыз жағдайларынан зардап шегеді. Қазіргі кезде көптеген елдерде 30дан аса энтомопатогенді(жәндіктер үшін патогенді) препараттар өндіріледі. Олар белгілі бір жәндіктердің түрлерінің жоғарғы телімділігімен және адамға, жануарлар мен құстарға қауіпсіздігімен сипатталады. Микроорганизмдер негізінде алынатын энтомопатогенді препараттар биоценоздарда жағымсыз өзгерістерді болдырмайды және аймақтағы экологиялық жағдайды өзгертпейді. Бактериалды энтомопатогенді препараттардың маңызды көзі болып Bacillus thuriagiensis табылады. Бұл топтың бактериялары бірнеше жүздеген зиянды жәндіктерге үшін, соның ішінде жапырақжейтін жәндіктер үшін – алма, жүзім, орамжапырақ, орман ағаштарының зиянкестері үшін патогенді болып келеді. Оларға тән қасиеті – жасушада жәндіктер үшін токсикалық кристалды қоспалардың болуы. Токсин гусеница ішегінің параличін туғызып, оның эпителиінің ыдырауына әкеледі. Препараттардың өндірісінде Bac.thuringiensis-нің 4 түрінің маңызы бар: I) var.dendrolimus - дендробациллин препараты; 2) var. galleriae - энтобактерин препараты; 3) var. insectus - инсектин препараты; 4) var. alesti - алестин. Микробты препараттар порошок(ұнтақ) және дуст түрінде шығарылады. Алу технологиясы негізделген: тереңдік культивирлеу: себінді материалды лабораторияда арнайы аппараттарда өсіру, ферментерде өндірістік культивирлеу, культуралды сұйықтықты концентрлеу, кептіру, дайын препаратты стандарттау және орау. Микроскопиялық саңырауқұлақтар негізіндегі препараттардың көптеген зиянды жәндіктерді жою мүмкіндігі бар, жәндіктерде микоз ауруын туғызады. Саңырауқұлақтық энтомопатогенді препараттар Beaveria саңырауқұлағын(ақ мускардина қоздырушысы) культивирлеуге негізделеді. Саңырауқұлақ жасанды орталарда оңай культивирленеді. Спораларын центрифугалайды да, толтырғышпен(тальк, бор, т.б.) араластырады. Зиянды жәндіктермен күресу үшін жәндіктердің вирустарын қолдануға болады. Жәндіктердің ауруларын туғызатын 300 вирус белгілі. Вирусты препараттарын дайындау қиынға соғады, себебі вирустар тек тірі жасушаларда ғана көбееді. Препараттар: вирин - ЭНШ (против непарного шелкопряда), вирин-ЭКС (против капустной совки) и вирин - АББ (против американской белой бабочки). Биологиялық (бактериалды) тыңайтқыштар. Нитрагин – Rhizobium туыстығының белсенді түйнек бактериялардың негізінде дайындалған бактериалды тыңайтқыш, ол бұршақ тұқымдастардың(бұршақ, фасоль, соя, клевер, люцерна, т.б.) өнімін жоғарлатуға арналған. Нитрагиннің өнеркәсіптік өндірісі асептикалық биотехнологиялық өндіріске негізделген. Культивирлеу үшін жүгері экстракты, меласса, минералды тұздар сияқты компоненттері бар қоректік ортаны қолданады. Азотобактерин – Azotobacter chro-ococcum микроорганизмнің культурасының негізінде алынған бактериалды тыңайтқыш. Bacillus megaterium-нан алынған фосфобактерин препараты күрделі органикалық қосылыстарды қарапайым қосылыстарға дейін ыдыратады.

Отечественное биотехнологическое производство выпускает 3 группы энтомопатогенных препаратов:

1. Бактериальные препараты на основе Bacillus thuringiensis - энтобактерин-3, дендробациллин, инсектин, токсобактерин.

2. Грибной препарат боверин на основе гриба Beauveria bassiana.

3. Препараты на основе вирусов ядерного полиэдра (вирин-ЭНШ, вирин-ЭКС и др.).

Из всех энтомопатогенных бактерий наиболее исследованы грамположительные бактерии Bac.thuringiensis. Она не только разрушает насекомое, попадая внутрь, но и продуцирует ряд токсичных продуктов. Среди этих токсичных продуктов выделяют 4 компонента:

- α-экзотоксин, или фосфолипаза С, - продукт растущих клеток бактерий. Токсическое действие фермента связывают с индуцируемым им распадом незаменимых фосфолипидов в ткани насекомого, что приводит к гибели последнего.

- β-экзотоксин - накапливается в культуральной жидкости при росте клеток. Считают, что молекула β-токсина состоит из нуклеотида, связанного через рибозу и глюкозу с аллослизевой кислотой. Его действие, видимо, обусловлено ингибированием нуклеотидазы и ДНК-зависимой РНК-полимеразы, связанных с АТФ, что приводит к прекращению синтеза РНК. По сравнению с другими токсинами действует медленнее, в основном при переходе от одного цикла развития к другому. По наблюдениям, β-экзотоксин - мутаген, поражающий генетический аппарат особей.

- γ-экзотоксин - малоизученный компонент, неидентифицированный фермент (или группа ферментов).

- δ-эндотоксин - параспоральный кристаллический эндотоксин. Образуется в процессе споруляции бактерии в противоположной от формирующейся споры части бактерии. На завершающей стадии спорообразования токсин приобретает форму 8-гранного кристалла. Кристаллы состоят из белка, аминокислотный состав которого близок для различных штаммов. Доказано, что кристаллический белок в кишечнике восприимчивых насекомых распадается на молекулы протоксина. Протоксин под действием протеиназ распадается на токсические фрагменты. Различие в восприимчивости некоторых видов насекомых к действию кристалла, по-видимому, связано с присутствием специальных кишечных протеаз, осуществляющих гидролиз кристаллов in vivo. Такими протеазами обладают не все насекомые, отсюда и избирательность действия δ-токсина. Чтобы насекомое погибло, кристаллы должны попасть в его организм. После поглощения кристаллов гусеницы перестают питаться. Первичным местом действия δ-токсина является средний отдел кишечника.

Биотынайтқыштар.Атмосфералық азотты фиксациялайтын микроорганизмдер өсімдіктерді азотпен байыту көзі ретінен басқа олардың өсуін ширататын гормондар түзеді, фитопатогенділерге антагонизмдік байқатады.

Жерді тынайтататын түйнек бактерияларының биомассасы бар препараттар ауыл шаруашылығында 100 жылдан астам қолданылып келеді, егінді 5-20% (соя, үрме бүршағы, бүршақ) жоғарла-тады.

Келесі микроорганизмдер топтары қолданылады:

• түйнекті бактериялар туыстары - Rhizobium (жылдам өсетіндер) және Bradyrhizobium (бәсеңдеп өсетіндер); нитрагин препараты; бүршақ дақылдары (Rh. trifolii - жоңышқа, Rh. japonicum -соя, Rh. faseoli - үрме бүршағы, Rh. lupini- люпин және басқа);

• Frankia, актиномицеттер, ризобий секілді ағаштар тамырларында және бүталарда симбиозды азотты фиксациялайды;

- Azotobacter, азотобактерин препараты, негізінен оранжереялык, және парниктегі өсімдіктерде кездеседі, бос күйде тіршілік ететін микроорганизмдер, симбиоздық емес азотты фиксациялайды;

• Agrobacterium, Arthrobacter, Azospirillum және басқа прока­риоттар симбиозды емес, ассоциативті азотфиксациялау жүргізеді (ризосферада, ризопланда - тамырлар бетінде). Осы топ бактерия­лар арасында фитопатогендері кездеседі, мысалы, Agrobacterium tumefaciens;

• Көк-жасыл балдырлар (цианобактериялар) Tolypothrix tennis, Anabaena cylindrica, Nostoc linckia және т.б. Вегетациялық кезең уақытында 1 га 50 кг дейін атмосфералық азот байланысады, бірақ, оларды дақылдандыру үшін өте көп су мен күн сәулесі қажет.

Биотыңайтқыштар Германияда алғашқы тыңайтқыш - нитра­гин жасалган кезде 1896 жылдан бастап ауылшаруашылығында өндіріліп, қолданыла бастады. Қазіргі уақытта егіс алқаптарында әртүрлі биотыңайтқыштар қолданылады, солардың ішінде:

• ризоторфин (Rhizobium), ақуыз және витаминдер мөлшерін көтеріп бүршақ, соя, асбүршағының және т.б. өнімдерінін шы-ғымдылығы 5-20% дейін артырады;

• азотобактерин (Azotobacter), жылыжайлық және парникті өсімдіктерде биотин, гетероауксин, гиббереллин, никотин және пантетен қышқылының синтезін күшейтеді;

• цианобактерияларды колдану - альголизация (азот бекітетін көкжасыл балдырлардың 130 жуық түрі) - Anabaena, Nostoc, Toly-pothrix және т.б., күріштік және суармалы eric алқаптарында.

Бактериалық тыңайтқыштарды биореакторларда ферментация нәтижесінде алады, биомассаны сепарациялайды, концентрация-лайды, кептіреді және себу алдында топыраққа енгізіледі.

Цианобактерияларды инсоляция жагдайында арнайы бассейн-дерде дақылдандырады, 3 аптадан кейін 1 га су бетінен суарылған және күріштік егіс алқаптарында колданылатын 15 тоннаға жуық биомасса жиналады.

Егер азот бекітетін прокариоттар өсімдіктердің азотқа қажетті-лігін қанағаттандырса, сондықтан топырақтагы байланысқан азот-қа тәуелді болмаса, онда саңырауқүлақтар оларға фосфор жеткі-зуді қамтамасыз етеді. Саңырауқүлақтар және өсімдіктер симбио­зы нәтижесінде микориза түзіледі. Саңырауқүлақтар тамырлық жүйеде көбейіп, оның көлемін үлғайтады және фосфаттарды өсім-діктермен жеңіл сіңірілетін ерігіш қосылыстарға ауыстыра алады.

Микроорганизмдер өсімдіктер клеткаларына дейін азот пен фосфорды жеткізуді жеңілдетумен қатар циклді қүрылыстың томен молекулалы, азотсыз қосылыстары болып табылатын өсуді реттеуші синтез жолымен өсімдіктердің өсуі мен дамуын реттейді:

• ауксиндер, саңырауқүлақтармен (Nectria galligene), бактерия-лармен (Azotobacter, Rhizobium) синтезделеді;

• гиббереллиндер, саңырауқүлақтармен (Fusarium moniliforme, Collybia conigens), актиномицеттермен (Actinomyces chromogenes, A. flavus), бактериялармен (Azotobacter, Agrobacterium, Rhizobium) синтезделінеді;

• цитокининдер, саңыраукүлақтармен (Nectria galligene, Taph-rine spp., Cytospora spp.), актиномицеттермен (Streptomyces spp.), бактериялармен (Azotobacter, Agrobacterium, Rhizobium) өндіріледі.

Арпа, күріш, бидай, қонақ жүгері (сорго) дәндерін өңдеуде инокуляторлар ретінде Azospirillum (A. brasielense, A. lipoferum) бактерияларын қолдану кезінде өнім 10-30%-ға жоғарылайды.

Фитопатогендердің өсуі мен көбеюін тежеу субстратка бәсеке үрдісінде немесе антибиотикалық заттар өнімдерімен қамтамасыз етіледі: -ризосфераға тақау топырак қабатында болатын, темірдін көп бөлігін байланыстыратын сидерофорлар синтезі. Фитопатогендер сонымен қатар сидерофорларды синтездейді, бірақ ризосфералық бактерияларға қарағанда темірге байланғыштығы төмен. Ризосфе-ралық бактериялар субстратқа бәсекеден тыс қалады;

- фитопатогендердің өсуі мен көбеюін тежейтін антибиотик-тердің өндірілуі. Мысалы, псевдомонадалар, агробактериялар және т.б. фитопатогендерді тежейтін агроциндер, гербиколин, оомицин, феназин, пирролнитриндерді синтездейді.

Кейбір микроорганизмдер (псевдомонадалар, энтеробактерия-лар және т.б.) патогенді саңырауқұлақтардың клетка қабырғасын бұзатын ферменттерді (липазалар, хитиназалар, протеазалар) син-тездейді.

5. Вируспен залалданған өсімдіктерді балау әдістері. Өсімдік ауруларын балау барысында иммунды ферменттік талдауды қолдану. Вирус ауруларын анықтау әдістерініѕ сезімталдығы жоғары және сенімді ғана емес, талдау жүргізгенде өте тиімді болуға тиісті.

1.Сырттай көзбен тексеріп, сараптау арқылы ауруды анықтау. Көптеген жағдайда өсімдіктіѕ ауруға шалдыққаны жөнінде сыртқы белгілері арқылы қорытынды жасауға болады. Өсімдік өсуіндегі ауытқуларды, хлороз, некроз, жапырақ теѕбілі, сонымен бірге, өсімдік сабағында, гүлінде, жемісінде, тұқымда және түйнекте байқалатын өзгерістерді бағалап, болжауға болады.

Көзбен көру арқылы ауруды анықтау әдісі өте қарапайым, ол үшін арнайы жабдықтар керек емес, бірақ бақылаушыныѕ белгілі тәжірибесі мен білімін талап етеді. Бұл әдістіѕ негізгі кемшілігі әр түрлі вируспен шалдыққан өсімдіктердіѕ ауру белгілері өте ұқсас болғандықтан, оларды айыру қиын. Тіршілік ортаныѕ өзгеруі, кейбір қоректік элементтердіѕ жетіспеуі немесе артық болуы, гербицидтерді дұрыс пайдаланбауы, патогендік саѕырауқұлақтардыѕ әсері және басқа да жағдайлар бір-біріне ұқсас өзгерістерге әкелуі мүмкін. Тұқым өсіру шаруашылығында сырттай анықтау арқылы ауруды жұқтырған материалды алдын ала бағалауға болады.

2.Электромикроскопиялық анықтау. Әдетте, бұл әдісті ауруды туғызатын вирус белгісіз болғанда, яғни, жалпы вирусты анықтау үшін қолданады. Өкінішке орай, бұндай күрделі әрі кымбат әдістіѕ кемшіліктері көп.

3.Индикаторлық анықтау әдісі – вирус инфекциясын индикатор -өсімдікке көшіргенде өсімдік зақымдалып, белгілі реакциялар арқылы жауап береді. Бұл өте күрделі және көп еѕбекті қажет ететін әдіс.

4.Серологиялық анықтау әдісі жылы қанды жануарлар иммунитетіне негізделген.

5. Иммуноферменттік талдау әдісі иммуноглобулин ақуызын сіѕіру қасиетіне, антиденешіктерге ферменттер көөмегімен белгілерді салуына негізделген.

6. Иммунологиялық емес диагностика молекулалық деѕгейде өтетін нуклеин қышқылдарыныѕ будандасуымен байланысты.

Өсімдіктерді вирус ауруынан сауықтыратын тиімді әдістерініѕ бірі - меристема өсіндісі. Еѕ бірінші меристемаө өсіндісін Г. Морель мен К. Мартина 1952 жылы қолданып, сауықтырылған нарғызгүл мен картопты алады. Қазіргі кезде меристема ұлпасында вирус ауруыныѕ неліктен таралмайтындығы толық анықталмаған. Кейбір зерттеушілердіѕ айтуына қарағанда, вирустардыѕ жасушадан жасушаға баяу таралуы меристемада өткізгіш жүйеніѕ болмауына байланысты, ал екінші пікір бойынша, меристема жасушаларыныѕ ерекше метаболизмініѕ күйіне байланысты. Соѕғы кездерде меристема өсіндісін вирус ауруларынан сауықтыру үшін хемотерапиямен бірге ыстықпен өѕдеу әдістері қолданылып, тиімді нәтижелер алынды.

Билет 6 1.Антидене туралы түсінік. Антиденелер синтезінің механизмі, биологиялық рольі. Антиденелердің физика-химиялық қасиеті және молекулярлық құрылымы. Антиденелердің қалыптасу теориясы.

Гуморалдық иммунитеттің негізін телімді антиденелер құрайды. Антиденелер – антигендердің әсерінен организмде В-лимфоциттері (плазматикалық жасушалар) түзейтін және осы бөгде заттармен әрекеттесе алатын (телімді) ақуыздар – иммуноглобулиндер. Иммуноглобулиндердің бес класы белгілі: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE. Иммуноглобулиндер – екі ауыр (әрқайсысының молекулалық салмағы 50000 Д) және екі жеңіл (әрқайсысының молекулалық салмағы 25000 Д) полипептидтердің тізбектерінен тұратын ақуыз. Иммуноглобулиннің молекуласында жеңіл және ауыр полипептидердің әрбір жұбы бір бірінен айнымайтын тізбектер. Полипептидтің әрбір тізбегі вариабелді (өзгермелі) және константты (тұрақты) бөлімдерден құрастырылғын. Антидененің вариабелді бөлімінде антигендермен әрекеттесе алатын белсенді орталықтары орналасады. Антиденелер бір антигенді екіншісінен ажырата алатын қабілетке ие. Олардың әрқайсысы тек өздерінің пайда болуына себепкер болған антигендермен ғана әрекеттесе алады. Антиденелердің бұл қасиеті оның комплементарлығы деп белгіленеді. Антиген-антидене реакциясы организмге әрдайым пайдалы болмай, кейде залалды да болып келуі мүмкін. Айталық, аталмыш реакциялардың нәтижесінде денеге енген заттар, соның ішінде микробтар өңделіп, фагоцитозға жеңіл тартылады, бөгде ақуыздар бейтарапталынады, трепонемалар, лептоспиралар, келімсек жасушалар талқандалынады. Сонымен қатар кейбір жағдайларда антиген-антидене кешені анафилаксияны, есекжемді, демікпені және басқа аллергиялық реакцияларды тудырады.

Телімділігі бірдей антиденелер белгілі бір антидене өндіруші жасуша клонының өнімдері болып табылады. Бір лимфоцит клонының өнімдері моноклоналды антиденелер деп белгіленеді. Әрбір бөгде зат антигендердің кешенінен құралатынын ескерсек, оған қарсы иммунды жауапты қалыптастыруға лимфоциттердің бірнеше клондары қатысатын болады. Міне сондықтан да организмде бөгде затқа қарсы түзілген антиденелер жиынтығын поликлоналды антиденелер деп атайды. Моноклоналды антиденелерді зертханалық жағдайда гибридома технологиясының көмегімен алуға болады.