23 Билет

1 In vitro -  тірі аєзалардыѕ жасушаларын, ўлпаларын «шыныда», залалсыз жаєдайда жасанды ќоректік ортада ґсіру јдісі.

In vivo – ағзадан тыс жерде өсіруАуылшаруашылық жануарлардың in vitro – да ұрықтандырудың ғылыми жетістіктеріне тоқталмас бұрын, осы әдістің зертханалық жануарларда жүргізілетін негізгі кезеңдеріне тоқталған жөн. Бұл жетістіктерге тоқталмай ауылшаруашылық жануарлардың in vitro-да ұрықтану әдісінің жетістіктері мен кемшіліктерін түсіну және осы мәселелердің дұрыс шешіміне келу қиынға соғады.

Сүт қоректілерді in vitro жағдайында ұрықтандыру әдісінің негізін салу үшін, сол in vivo процесін толығымен біліп, көптеген зерттеулер жүргізу қажет. Сондай – ақ қызығушылық тудыратын мәселелердің бірі болып аталық - аналық жыныс гаметаларының ұрықтануының ұрғашы жыныс жолында сақталу ұзақтығы болып табылады.

Аналықты түрлі уақыт аралығында овуляцияға дейін ұрықтандырсақ түрлі жануарлардың сперматозоидтарының ұрықтану қасиеті түрліше жүреді: тышқандарда - 12 сағат аралығында, егеуқұйрықтарда – 18-20 сағат аралығында; ал овуляциядан кейін ұрықтану мүмкіндігі қояндарда -8 сағат, тышқандарда -5 сағатқа дейін қысқарады (Chang, 1984).

Келесі in vitro-да сүтқоректілерді ұрықтандырудың негізгі кезеңі сперматозоид капоцитациясының ашылуымен байланысты. 1951 ж. Chang және онымен бір мезгілде Austin сүтқоректілердің ұрықтануының жүруі жұмыртқа жолында овуляцияға дейін сперматозоидтардың болуымен байланысты деген. Осы уақыт аралығында олар физиологиялық өзгерістерден өтіп, ұрықтану мүмкіндігіне ие болады. Осы жоғарыдағы хабарламаға негізделіп, сондай– ақ өзі түрлі булану аралығында егеуқұйрықтың жұмыртқа жасушасына сперматазойттың енуін меңгеру барысында Austin биологиялық әдебиеттерге «капацитация» терминін енгізді. Бұл сперматазоид ұрықтану мүмкіндігі ие болғанға дейін, кейбір физиологиялық өзгерістерге ұшырауы тиіс деген сөз.

Кейін 1959ж Chang, қоян сперматазойттарының декапацитацясының мүмкіншіліктерін көрсетті. Сперерматазоид капацитациясының ашылған құбылыстарына негізделіп (Chang 1959ж) бірінші рет қоян жасушасында капацитацияланған in vitro-да ұрықтанған сперматазоидтарды жұмыртқа жасушасына көшіріп ұрпақ алынды. In vitro-да ұрықтандыру әдісі келесі кезеңдерден тұрады.

Сперматазоид капацитациясының аналық жыныс жолында өңделгеннен кейін, in vitro капацитацияның мүмкіндігінде көрсетілді.

60 жылдардың соңына дейін in vitro-да сперматозоид капацистасының қоректік ортасында биологиялық ерітінділерді қосты, олар жұмыртқа жолымен фоликула ерітіндісі немесе жылумен өңделген қан сарысулар. 1971 жылы биологиялық ерітінді қосылмаған, бұқаның сарысуының альбуминімен натрий перуваты қосылған қоректік ортада тышқанды in vitro-да ұрықтандыру мен капацитациясына қол жеткізілді. Тышқандардың in vitro-да ұрықтануы мен сперматазоид капацитациясының негізгі ортасы. Құрамында глюкоза мен, қан сарысуы альбумині және лактат пен натрий пируваты бар Кребс-Рингер ерітіндісі болып табылады.

Түрлі сүтқоректілерде сперматазоид капацитациясының механизмінің көптеген ұсыныстарынан кейін иммунологиялық әдістің көмегімен, бұл процесс сперматазоид беткейін жауып тұратын ауыспалы плазма компоненттерінің жоғалуы мен қайта құрылуынан тұратын анықталған (Oliphant, Brackett, 1973ж).

Авторлар in vitro-да қоян сперматазоидтарының капатациясының келесі техникасын ұсынды. Сперматозоидтарды 3-5мл дифенитивті ортамен суспензиялап, жуып-шаяды және 734 х d-те 5 мин бойы центрифугалайды. Бөлінген сұйықтықты төгіп, тұнбасын қайтадан 2 мл жаңа ортада суспензиялайды.

Осы кезеңде кәдімгі дифенитивті дайындалғаннан немесе гипертониялық ортаны қолданады, оның осмостық қысымын NaCl қосу арқылы380 м осм/кг жеткізеді.

Сермататазоидтарды 2 мл изатониялық дифенетивті ортасында ресуспензиялайды. Сондай-ақ оларды экспериментальды ортада 20 мин бойы, инкубациялап, соның ішінде 5-минуты центрифугалайды. Бұл бөлме температурасында (25°С) жүргізіледі. Кейін сперматозоидтарды 38°С су моншасында инкубациялайды.

Сонымен in vitro-дағы сперматазоид капацитация процессі ауыспалы плазманың шайылуы мен ұрықтану алдында бірнеше сағат бұрын спермаларды инкубациялаудан тұрады.

In vitro-да ұрықтандыру техникасы келесідей. Ооцитті кумулюсті жасушалармен жұмыртқаның беткейінен жинап, оларды кішкене культуралық ыдысқа (30 мм диаметрлі және12 мл тереңдігі) құрамында 4 мл дифенетиві бар ортаға (305 м осм/кг) отырғызылады. Егер сперматазоидтар осы уақытта отырғызуға дайын болмаса, онда құрамында жұмыртқа жасушасы бар ортаны май жабындысы мен жауып 5% CO² ылғалды атмосферада, 38°С ауа температурасында сақтайды. Осындай жағдайда тек 30 минут қана ұстауға болады.

Отырғызуды шамамен 0¸1 мл жаңа овуляцияланған жұмыртқа жасушасына 4 мл ортаны және 10⁶ сперматазоидты қосады. Отырғызылғаннан кейін құрамында гаметасы бар ыдысты 5%CO² ылғалды атмосферада, 38°С ауада инкубациялайды. Көшіруден кейін 1762 мен 4- жасушалық эмбриондардан 24 эмбрион семплантацияланып, бірақ көп бөлігі сорылып қалады. Тышқандарды сперматазоид капацитациясының жатыр мен in vitro-дағы ұзақтығы 1-2 сағ құрайды, егеуқұйрықтарда 5-6 сағ, ал in vitro-да 10 сағ. Қоян жатырында 6 сағ, ал in vitro-да 10 сағ. Сонымен, шамамен 3 онжылдық бұрын аналық жыныс жолында сперматазоидтар мен жұмыртқа жасушасының ұрықтану мүмкіндігі анықталған, сперматозоидтардың капацитация құбылысы ашылып, қоян ,тышқан, егеуқұйрықтың жұмыртқа жасушасының in vitro-да ұрықтандыру әдісі шығарылды. Зертханалық жануарлардың зерттеулерінің мәліметтері 70 жылдың басында in vitro-да ауылшаруашылық жануарлар мен ірі қарадан ұрпақ алуға жол ашты. (Brackett et al 1982, Эрнест 1983 ж)

Ірі қараларды ағзадан тыс ұрықтандыру. Бірінші кездері in vitro-да культивирлеуде алдын ала ұрықтанған реципент жұмыртқа жолына ооцитті отырғызады. Nemcomb et al (1978 ж) осы жолмен ұрықтанын басқа жануардың жұмыртқа жолында жүргізілген.

Соңғы жылдары ирландиялық зерттеушілер (Lu et al 1987 ж- 1988ж) ірі қара ооциттерін in vitro-да ұрықтандыруда үлкен жетістіктерге қол жеткізді. Олар фоликулярлы ооциттерді М 199 гормонды қоспасы бар ортада немесе оларсыз 20% эстраьды сиырдың қан сарысуында культивирледі. Ортаға кумулюсты жасушаларды қосты (5-7 млн/мл) культивирлеуді 24-26 сағ. Бойы 39°С температурада, ортаны ақырын шайқауымен және максимальды ылғалдығы 5%СО² болу қажет.

Ұрықтандыруды Тиройд ортасының тамшысында 18-20 сағ. Бойы жүргізіледі.Содан соң ооциттерді қойдың лигатурлы жұмыртқа жолына 6-7 күнге отырғызады. Бірінші хабарламада 85% ооциттер 2- жасушалық және одан да көпке ажыратылады. Сонымен морула мен бластоциста сатысында ооциттердің жету шегі 38,5% құрады. Олардың жетілуі гормональды препараттар қосылған ортада (ФСГ, ЛГ, ЛТГ және эстрадиол) өтті. Хирургиялық емес жолмен эмбриондарды көшіруде 74%, яғни 19 бұзаудың 14-і тірідей алынды.

Осы зерттеушілердің екінші зерттеуінде экспериментальды материал үлкен көлемде пайдаланылып, жетілмеген 837 ооцит алынды. 837-нің 717-сі культивирленген ооцитерге ұрықтануға жеке бөлініп алынды. 668 ооцит қойдық жұмыртқа жолына көшірілді және 6 күннен кейін 420 (63%) жұмыртқа жасушалары мен эмбриондар алынды.

420 жұмыртқа жасушасының 333 (80 %) – і 2 – жасушалы және одан да көпке ажыра сатысына жетеді, 191 (46%) морула және бластоциста сатысына жетеді.

Сонымен уақытша реципиентті қолданып in vitro-да ооциттерді культивирлеу әдісі трансплантацияға жарамды ірі қараның эмбрион сатысын көптеп алуға мүмкіндік береді.

Қойларды in vitro – да ұрықтандыру. Moor, Trounson (1977) ооцитерді фолликула ішінде культивирледі, кейін тұқымданған реципиенттің жұмыртқа жолына отырғызылады. 26-дан 50%-ға дейін ооцитер бластоциста сатысына дейін дамиды. Басқа реципиентке көшірілгеннен кейін алынған бластоцистаның өміршеңдігі 52% құрайды.

Bondioli , Wright (1980) бірнеше ортаны қолданып олардың әсерлілігін және ақуыздың in virto ұрықтанудағы ооциттер овуляциясына және дамуына әсерін тигізді. Зерттеушілер қоректік орталардың айырмашылығы, бірақ көптеген тәжірибелерде ооциттердің жоғары % байқалды.

Ауылшаруашылық жануарлардың эмбриондарын in vitro-да өсіру. Ірі қара мен қойдың эмбриондарын культивирлеу әдісінің бірінші кезеңінде культивирлеу ортасы ретінде сол түрдің өзінің қан сарысуы қолданылып жүрді. Эмбриондардың дамуы тек бір рет бөлінумен ғана шектеліп, 48 сағаттан соң тоқтайтын болған.

Соңғы кездері фолликулярлық ерітіндімен түрлі культивирлеу ортасы қолданылып жүр. Davis, Day (1978) модификацияланған бикарбонатты Кребс – Рингер ортасында 1 – 4 жасушалық эмбриондар мен моруланың пайымды дамуын зерттеген. Бұл ортаға келесі компоненттер кіреді: глюкоза, лактат, БСА. 1-2 жасушалық эмбриондардың дамуы 4 – жасушалық сатыға дейін жететіні анықталды. 4–жасуша эмбриондарын in vitro жағдайында бластоцистада дамуы жануар ағзасындағыдай өтеді.

2 Ақуыз – адамдар мен жануарлар тағамдарының ең тапшы компоненттерінің бірі. Ақуыздардың микробтық синтезі тағамдық базаның сапысн кеңетйуге, жақсартуға, аз ғана жұмыс күшін жұмсап сыртқы ортаға нұсқан келтірмей жоғары сапалы өнім алуға мүмкіндік береді.

Микроорганизмдер ақуыз мөлшері аз өсімдік биомассаын ақуыз мөлшері көп тағамдық өнімге айналдыра алады. Ірі өнеркәсіптік масштабтарда бұл үрдіс әісересе Бірніші дүние жүзілік соғыс кезінде Германияда қолданылып келді. Олар Saccharomyces cerevisiae ашытқысын өсіріп, шұжық және сорпа дайындау үрдістерінде қосып отырған. Осылайша 60%-ке дейін импорттық ақуыздық тағамдармен қамтамасызданыдырып отырған. Осыған ұқсас үрдістер екінші дүние жүзілік соғыс кезінде Candida arborea және Candida utilis тағамдық ашытқылар негізінде қолданылған. 60 жылдары мұнай және химиялық компаниялар бір жасушалы органимздерден адамдар мен жанаурлардың тағамдарына қосуға арналған ақуыздарыд алудың жаңа үрдістерін қарастырып, әзірлеу және зерттеу жұмыстарын жүргізе басатды. Субстрат ретінде мұнай, метанол, метан және крахмал қолданылған.

Кейінгі жылдары амин қышқылдарын аэробты микробиологиялық үрдістермен өндіру жолы кеңіне қолдау таба бастады. Әсіресе өзгеше дәм беруші глутамат натрий және тағамдық қоспа ретінде қолданылатын Лизин көп мөлшерде өндіріліп отырылды.

Ақуыз өндіру кезінде қолданылатын микроорганиизмдерге Candida, Hansenula, Trichosporum, Zygofabospora, Aspergillus, Fusarium, Mucoraceae тобындағы саңырауқұлақтары мен ашытқыларын жатқызуға болады.

Тағамдық және азықтық ақуыздарды екіншілік өнім ретінде көмірсулы субстрарттарды Candida utilis ашытқыларымен ашыту кезінде, сыра өндіріснде Saccharomices cerevisiae спирттік ашытуда және Kluyveromyces fragilis бактерияларымен сүт қышқылды өнімдер мен сүт сарсуларын алу кезінде қолданылады. Биомассаға қойылатын басты талаптардың бірі, - бұл токсиндер, ауыр металдар және патогенді микроорганизмдер болмауы керек.

Микроорагнизмдерді қолдану арқылы өнеркәсіптік деңгейде ақуыздарды алу реттілігі хемостат принципі бойынша жұмыс істейтін ферментаолрлар арқылы іске асырылады. Микроорганизмдер көбейіп жатқан ортаға үрдіске маңызды органикалық субстраттарды және минералды тұздардың сулы ерітіндісін үздіксіз жіберіп отырады. Дақылды араластырып, аэрациялап және салқындатып отыру қажет. Үрдіс кезінде міндетті түрде максимальды темпратурада өсіп өне алатын термотолерантты штаммдар қолданылады. Ұдайы термаотолерантты штаммдарды қолдану өсіру үрдісінің температусарысн бір қалыпқа келітіруге мүмкіндік береді. Сонымен қатар басқа бөгде микрофлралардың түсуіне жол бермейді және салқындатуға кететін шығындарды азайтады.

Жоғарыда атылған сатылардың телімділігі көбінесе өсірілетін микроорганизмдердің ерекшеліктеріне байланысты. Мысалы өсірлген ашытқы жасушаларын сулы ортадан сеперациялау, ал саңырауқұлақ жасушаларын фильтрациялау арқылы бөліп алуға болады..

Биохимиялық технологияның қарқынды дамуына орай микроорганизм өсінділерін газойль, парафин, табиғи газ, меласса және целлюлоза метаиалдарының субстраттарында аэрацияланатын ферментерлерде өсіреді.

Қазіргі кезде тағамдық азықтардағы амин қышқылдарын өндіруге көп көңіл бөлінуде.

Мысыалы дүние жүзілік денгейде алып қарайтын болсақ жылына 200 мың тона глутамин қышқылы, 160 мың тонна метионин, 50 мың тонна лизин, 7 мың тонна глицин, 100-200 мың тонна триптофан өнділеді екен.

Сонымен қатар кішігірім масштабта лейцин, изолейцин, пролин, треонин (130 мың жылына) және басқада амин қышқылдары өндіріледі.

Дүните жүзілік тәжірибеде микробиологиялық синтездің көмегімен 60% амин қышқылдарын өндіруге болады.

3 Ферментация үрдістерінің негізгі сипаттамалары. Микроорганизмдерді өсіру үрдістерінің стехиометриясы

Ферментациялық технология кезінде бүтін тірі жасушаларды (микробтардың, жануарлар мен өсімдіктердің жасушалары) немесе органикалық заттарды физикалық және химиялық жолмен айналдыру мақсатында қолданылатын қандай да бір жасушалық компоненттерді (мысалы ферменттер) пайдалануға болады. Алайда қажетті заттарды алуда қолданылатын әдістердің тиімділігі төмен, соңдықтан қажетті өнімдерді алуда қолданылатын технологиялық әдістердің тиімділігі неғұрлым жоғары болуы керек.

Органикалық өнімдерді химиялық әдістерге қарағанда биотехнологиялық тәсілдермен өндірудің артықшылықтары:

• ақуыз және антибиотиктер сияқты көптеген күрделі органикалық молекулалар химиялық тәсілдермен синтезделмейді;

• биоконверсия мақсатты өнімнің көп мөлшерде шығуын қамтамасыз етеді;

• биологиялық жүйелер төменгі температура, жоғарғы рН маңызын реттеп отырады;

• химиялық катализдік реакцияларына қарағанда биологиялық катализдік реакциялары неғұрлым телімдірек болады;

• биологиялық үрдістер бір типті таза изомерлі өнімді алуға мүмкіндік береді, ал химиялық синтездің реакцияларында өнімнің құрамында басқада қажетсіз заттар синтезделуі мүмкін.

Биолгиялық тәсілдердің химиялық әдістерге қарағандағы кемшіліктері:

1. Биологиялық жүйелер тез және оңай бөгде микрофлоралармен залалдануы мүмкін.

2. Биологиялық тәсілмен синтезделген мақсатты өнім күрделі қоспадан тұрады, сондықтан оны керек емес заттардан тазалап бөліп алу қажет.

3. Биотехнологиялық өндірісте көп мөлшерде су жұмсалады, нәтижесінде жұмасалған су сыртқы ортаға шығарып тасталынады.

4. Стандартты химиялық үрдістермен салыстырғанда био үрдістер баяу жүреді.

Әр биотехнологиялық үрдістің өзіне сәйкес қалыптастырылған схемасы болуы керек, ал ондағы жүретін үрдістер үнемі бақылауда және қадағаланып отыруы қажет.

Ферментациялық технология өндірістік деңгейде микробтық синтез және ашыту процестерінің нәтижелерін жүзеге асырады:

• ферментация микроорганизмдердің биореакторларда өсуі мен көбеюіне негізделген және микроорганизмдер биомассасын немесе метаболиттерін (антибиотиктер, амин қышқылдары және т.б.) алуды мақсат етеді;

• ферментация микроорганизм (продуцентті) қоректік ортаға себуден басталып қажетті өнімді алуға, оны бөліп алуға және тазартуға дейін созылатын, белгілі реттілікпен өтетін технологиялық процесс болып табылады;

• ферментациялық процесті іске асыруына үш объект қажет: микроорганизмдердің (продуценттердің) таза өсінділері, көп компонентті қоректік орта және автоматты басқару мен бақылау блогі бар биореактор.

Қажетті өнімнің саны мен сапасы продуценттің биологиялық қасиеттеріне, субстраттың қоректік құндылығына және технологиялық процестердің инженерлік орындалуына тәуелді болып келеді.

Ферментациялық процесс зертхана жағдайында колбаларда продуценттерді өсіруден басталып үдемелі мөлшерде зертханалық және тәжірибелі-өндірістік биореакторларға қайта себуге ауысады. Себілетін материал саны қоректік орта көлемінің 5-10%-на дейін жеткізіледі. Себілген культурадағы микроорганизмдердің өсуін анықтау үшін, 1 мл ортадағы саны есептеледі, культураның тазалығы тексеріледі.

Сонымен қатар, кейін биореакторға енгізілетін культуральдық орта (субстрат) дайындалады. Культуральдық ортаның құрамы продуценттің зат алмасу процестерінің ерекшелігіне байланысты түрде таңдалады. Ортаға қажетті жағдайда мақсатты өнімнің бастауыш заты, микроорганизмдердің өсуіне, дамуына керекті стимуляторлар енгізіледі.

Ферментация. Қолданылатын микроорганизмдер тобына (бактериялар, актиномицеттер, мицелилі саңырауқұлақтар), алынатын өнімге (микробтық биомасса немесе олардың метаболиттері), байланысты ферментация процестерінің технологиясы, динамикасы, аппараттармен жабдықталуына байланысты:

• периодтық, үздіксіз және қоректік ортаны оқтын-оқтын қосумен өтетін;

• беткейлік және тереңдік, сұйық және қатты фазалы;

• аэробты және анаэробты ферментация болып ажыратылады.

Периодтық ферментация кезінде алдын-ала залалсыздандырылған биореактор жабық жағдайда гомогенизацияланған, компоненттік құрамы бойынша дайындалған, залалсыздандырылған қоректік орта мен себілетін материалдармен толтырылады. рН, температура, қажет болған жағдайда белгілі мөлшердегі аэрация және араластыру бекітіледі. Ферментация процесі біткен соң, биомассаны биореактордан шығарады. Ферментерді жұмысқа қайта дайындайды, залалсыздандырылады да, процесс қайталанады.

Егер периодтық ферментацияда микроорганизмдер ферментация барысында культуралдық орта жаңартылмай өсірілсе, онда субстратты қосумен өтетін мерзімді ферментацияда культураға оқтын-оқтын түрде белгілі мөлшердегі жаңа қоректік орта қосылып отырады. Егер процесс көп компонентті орталарда (меласса, жүгері экстракты, целлюлоза мен белокы бар әр түрлі заттар) жүргізілсе, онда қосымша қоректендіруді толық ассимиляцияланатын субстраттармен (сахароза, спирт, т.б.) жүзеге асырған жөн. Бұл мақсатты метаболит өнімін арттыруға мүмкіндік береді. Процесс біткен соң, биомассаны өңдеуге жібереді.

Үздіксіз ферментация кезінде жаңа қоректік орта үздіксіз, белгілі жылдамдықпен биореакторға құйылады да, аппараттан сондай мөлшерде культуралдық сұйықтықты немесе биомассаны шығарып отырады. Микробты клеткалар субстрат компоненттерінің концентрациясы, продуценттің меншікті өсу жылдамдығы периодты ферментацияға қарағанда тұрақты. Ферментацияны аэробты жағдайларда (биомассаны өсіру, антибиотиктер, амин қышқылдары, т.б. синтезінде) іске асыру үшін қарқынды аэрация және культуралдық сұйықтықты араластыруды, қатаң асептикалық жағдайларды, уақтылы көбікті басуды, т.б. қамтамасыз ету керек. Технологиялық процесс жалпы мынаған бағытталған:

• микробтық клеткалардан СО₂ әкетіп, О₂-мен қамтамасыз ету (аэробтар);

• культуралдық сұйықтықты қарқынды араластыру. Бұл гомогенизацияны, нутриентердің, микробтық клеткалар мен О₂-нің биореактор бүкіл көлемі бойынша біркелкі таралуын, іркілген өңірдің болмауын қамтамасыз етеді;

• биореактор мен онымен байланысқан коммуникацияның стерилизациясын жүзеге асыру, асептикалық жағдайды қамтамасыз ету;

• ферментациялық процесті бақылау және басқару жүйелерін автоматтандыру.

Анаэробты жағдайда ферментация этанолды, шарапты, органикалық қышқылдарды, сыра алуда және т.б. ашыту процестерінде жүргізіледі. Бұл жағдайдағы технологиялық процеске деген талаптары өзгеше:

• араластырудың ферментациялық процесс динамикасына әсері шамалы. Ол ашушы сұйықтықты, көрсеткіштер ретінде рН, температура, т.б. пайдаланып, гомогенизациялау үшін қажет;

• көптеген жағдайларда монокультураның өсуін қамтамасыз ету анағүрлым жеңіл, демек, залалсыздандыру мәселесі басты емес;

• көбік негізінен СО₂-нің шығуына байланысты пайда болады, оны басу оңай;

• шарап, сыра, т.б. ашыту өнімдерін өндіруде бірінші орынға жоғары өнімділігіне қарағанда олардың дәмдік қасиеттері шығады.

Сондықтан процестің қарқындылығына қолданылатын құралдарды таңдау әдетте өзекті емес.

Продуценттерді өсіруді беткейлік және тереңдік әдістермен жүргізуге болады.

Тереңдік әдіспен микроорганизмдерді сұйық қоректік орталарда өсіреді, бұл әдіспен аэробты және анаэробты микроорганизмдерді де өсіруге болады.

Беткейлік әдіспен микроорганизмдердің аэробты дақылын өсіруге болады. Әдетте тығыз ортада, кейде сұйық орталарда өсіреді.

Қатты фазалы ферментация мицелилі саңырауқұлақтарды өсіргенде кең қолданады. Субстраттық беттің жеткілікті ылғалдылығы, орта құрылымының қопсымалы болып, дақылдың бетін О₂-мен қамтамасыз етуі және СО₂ әкету үшін аэрациялау қажет. Мицелийдің қарқынды өсуі үшін оған жылы ауа үздіксіз берілуі тиіс. Қатты фазалы субстрат өсіруші камераға орналастырылады, субстрат қабатының қалыңдығы 200-300 мм аралығында және технологиялық ерекшеліктерге тәуелді. Өсіру камералары тік және көлденен секциялармен қатты фазалы ферментацияға арнайы құрастырылған аппараттарда орналасады.

Идиофазада екіншілік метаболиттер жиналады, спора түзілу процесі жүреді, ферментация процестері аяқталады. Мақсатты өнім мицелийден бөлініп алынады, өсіру камералары қоректік орталардан тазартылады, залалсыздандырылады, жаңа қоректік ортамен толтырылады, саңырауқұлақтар спораларымен себіледі де, процесс қайталанады.

Ферментацияның сұйық субстраттардағы беткейлік тәсілі желдетілетін ауа камераларына орналастырылған қоректік ортасы бар кюветаларда жүзеге асады. Микроорганизмдер дақылы бұл жағдайда сұйық бетіндегі жұқа қабат түрінде немесе қалың қабат түріндегі биомассаны түзеді. Дақыл оттегіні тура ауадан алады, продуцентті өсіру үшін кең өндірістік алаң керек. Сонымен қатар, өндіру процесінің төмен өзіндік құны және төменгі энергия сыйымдылығы органикалық қышқылдарды (лимон, итакон) және басқа өнімдерді өндірістік көлемде алуға мүмкіндік береді.

Тереңдік өсіру биореакторда, асептикалық жағдайда, ортаны интенсивті аэрациялаумен жүзеге асады. Масса алмасу үш фазалы жүйеде өтеді: сұйықтық - тығыз қоспа (микробтық клеткалар) - газ. Бұл фазалардың бір-біріне әсер етуінің оңтайлы жағдайларын жасау үшін, ферментациялық процестің түрлі аппараттармен жабдықталуы қажет. Ол биореакторда гидродинамикалық процесті реттеуге келіп түйіседі: сұйықтықтың, жылудың, газдың мөлшерлі құйылуы мен әкетілуі, микроб/субстраттық әсерлесуді қамтамасыз ету үшін тұрақты гомогенизацияланады; өсіру ортасының физикалық-химиялық параметрлерін қадағалау және басқару (рН, рО₂, t°С, және т.б.).

Эукариоттық белокдарды (инсулин, интерферон, т.б.) түзетін рекомбинантты микроорганизмдерді қолданумен өтетін ферментациялық процесс сатылап екі биореакторда өтеді. Алдымен рекомбинантты микроорганизмдердің биомассасы бірінші реакторда ұлғайтылады, кейін биомасса технологиялық параметрлері басқаша екінші реакторға ауыстырылады. Өзгерген жағдайларда рекомбинантты белок синтезінің индукциясы жүреді. Клондаған гендер индукциясы мен экспрессиясы әдетте клеткалар өсуінің экспоненциалдық фазаның аяғында сәйкестендіріледі.

Неліктен рекомбинантты белок синтезінің тұрақты экспрессиясында ферментациялық процесті бір реакторда жүргізу тиімсіз? Бұл жағдайда үздіксіз транскрипция мен трансляция кезінде продуценттің энергетикалық қоры бітіп, өсуі баяулайды да, мақсатты өнім синтезі кемитін болып шықты.

Екі биоректорлардағы үздіксіз ферментация сонымен қатар микробтық метаболиттерді алуда қолданылады, яғни екі кезеңді хемостат. Бірінші аппараттан шыққан орта екіншісіне өтеді. Сонымен қатар, екінші аппаратта жаңа субстратпен қосымша қоректендіру жүреді. Көптеген жағдайларда бірінші реакторда биомассаның қарқынды жиналуына жағдайлар жасалынады да, екіншісінде мақсатты өнімнің биосинтезі жүреді.

Ферментацияның нәтижелігі. Микроорганизм дақылының өсу мен даму динамикасында продуценттің қоректік ортаның компоненттеріне, аэрация деңгейіне, рН-тың оптимальды көрсеткіші, температуралық режим және т.б. сұраныстары өзгереді. Бұл процестерді үйлестіріп реттеу - био өнімді максимальді өндірудің жағдайын жасаудың кепілі.

рН

Беткейлік өсіру кезінде орта рН-ының биосинтез процесіне әсері төмен болады, өйткені ол қоректік ортаның жоғары буферлігі және ылғалдығы аздығынан өзгермейді, тереңдік өсіру ортаның рН шешуші роль атқарады, ол залалсыздандыру және әсіресе өсіру процесі кезінде өзгереді.

Саңырауқұлақтар мен ашытқылар үшін рН – 3,8-5,6, бактериялар үшін - 6,2-7,4, клеткалық метаболиттер культуралдық ортаға түсіп рН-ты айтарлықтай өзгертуі мүмкін. Қолайсыз рН-тың өзгеруі алдымен биосинтездік ферменттердің белсенділігінде, мақсатты өнім тұрақтылығында байқалады.

Аэрация

Оттегі продуцент - аэробтың өсуі мен көбеюіне қажет. Аэрация залалсызданған ауаның қоректік орта қабаты арқылы барботирлеумен (желдету) қамтамасыз етіледі. Оттегінің біркелкі таралуына және көпіршіктің дисперсиялануына араластыру жәрдемдеседі.

Оттегі нашар ериді, клеткалармен жылдам' пайдаланылады, сондықтан аэрацияның үздіксіздігі және жеткілікті болуы маңызды. Аэрация микроорганизмдер өсуінің экспоненциалды фазасында, биомассаның ұлғаюында анағүрлым қажет. Оттегіге мұқтаждық стационарлық фазада, екінші метаболиттер өндірісі ұлғайғанда төмендейді.

Температура

Биопродуценттер негізінен мезофилдерге жатады: саңырауқұлақтар – 22-23°С, бактериялар 35-37°С. Температуралық режим ферменттердің катализдік активтілігіне, жылу алмасуға, қоректік ортаның тұтқырлығына әсер етеді. Егер температура оңтайлықтан төмен болса, микроорганизмдер өсуі баяулайды, метаболизм қарқындылығы төмендейді. Егер, керісінше температура жоғары болса, белокдар синтезінің индукциясы ерте өтуі мүмкін.

Көбік басу

Аэрация және интенсивті араластыру жағдайында көбік көп түзіледі. Артық көбік биореактордың пайдалы көлемін азайтады, культуралдық ортаның бөтен флорамен контаминациясына ықпалын тигізеді. Көбік термодинамикалық тұрғыдан тұрақсыз: ескі көпіршіктердің жарылып жаңа көпіршіктердің түзілуі үнемі болып тұрады. Көпіршіктердің жарылу процесін тездету үшін механикалық құралдар немесе химиялық көбік басушылар кіргізіледі. Бірақ, көбік басушылардың артық мөлшері масса алмасу процесін, оттегін клеткаларға тасуды бұзуы мүмкін.

Біркелкі өндірістік шығындарда ферментация нәтижелігі немесе мақсатты өнім шығымдылығын арттыру, өсіру динамикасындағы тиімді басқару, физикалық-химиялық параметрлерді реттеу арқылы жүзеге асады.

Биотехнологиялық процестің табиғи өнімділігі қоректік ортаның оңтайлы құрамына, С, N, Р көздерінің артықшылығы немесе лимитациясына, мақсатты өнімнің бастауыш затына байланысты.

4Ферментация процесінің соңында қоректік ортада микроорганизмдер клеткалары, олардың метаболиттері, субстрат қалдықтары, реагенттер шығындалмаған (көбік басушылар, рН реттеуге арналған негіздер немесе қышқылдар ерітінділері) болады. Бұл құрылымы бойынша күрделі, құрамында қатты және сұйық фазалары бар орта.

Мақсатты өнімді бөліп алу процесі қатты және сұйық фазаларды ажырату, микробтық массаны, қатты бөлшектерді ерітінділерден бөліп алудан басталады. Қатты және сұйық фазаларда бөліп алу мен тазартудың келесі кезеңдері жүргізіледі. Бұл мақсатты өнімнің сипаттамасына байланысты (микробтық масса, клетка ішілік немесе клеткадан тыс метаболиттер).

Бөліп алу мен тазарту көп кезеңді процестер, сондықтан мақсатты өнімді бұзбайтын және культуралдық сұйықтықтан толық бөліп алатын әдістер комбинациясы қолданылады.

Бөліп алу әдісін таңдау культуралдық сұйықтықтың қасиетіне (дисперстік, жабысқақтық), мақсатты өнімнің физикалық-химиялық қасиетіне (термолабильді, тазарту технологиясында қолданылатын химиялық ерітіндіге сезімталдығына), мақсатты өнімнің ақырғы түріне қойылатын талаптарға (жалпы және биологиялық концентрация, тазалық дәрежесі, медициналық препарат, биотыңайтқыш, т.б.) байланысты.

Микробиологиялық синтез өнімдерін тазарту және бөлудің келесі әдістері қолданылады: сусыздандыру, құрғату, тұндыру, фильтрация, сепарация, экстракция, ион алмасушы адсорбция және т.б.

Құрғату. Құрғату культуралдық сұйықтықты қайта өңдеудің қарапайым әдістерінің бірі болып табылады. Құрғату өнімді таза түрінде бөліп алмай-ақ вакуум-буландырушы құрылғыларда жасалынады. Культуралдық сұйықтық паста тәріздес күйге немесе құрғақ затқа дейін концентрленеді. Бұл әдіс мал шаруашылығында лизин – азықтық амин қышқылын және азықтық В₂ және В₁₂ витаминдер концентраттарын алуда, өсімдік шаруашылығында биотыңайтқыштар және биопестицидтерді, тері өңдеу өнеркәсібінде ферменттер және т.б. алуда қолданылады.

Қатты фазалы ферментация кезінде мицелий биомассасы (саңырауқұлақтарды өсіргенде) қоректік орта бетінен алынады, жылы ауа арқылы конвективті кептірілуде үгітіледі.

Тұндыру. Тұндыру мақсатты өнім тұрақты болып, оған уақыт факторы әсер етпейтін жағдайда (тұндыру ұзақ процесс) жиі қолданылады.

Ферменттерді (белоктар) бөліп алу технологиясында тұнбаның тез түзілуі үшін, культуралдық ортаға нейтральді тұздарды (аммоний және натрий сульфаты, ас тұзы) қосады. Тұздар иондары әсерімен судың диполь ориентациясы артады, белок молекуласы айналасындағы гидратты қабат бұзылады және оның коагуляциясы басталады.

Органикалық ерітінділерде де (ацетон, этанол, метанол) белоктың гидратты қабықшасын белсенді түрде бұзады, әсіресе төмен температураларда (0-5°С).

Микробтық клеткаларды, үлкен молекулалы белоктарды тұндыру үшін қалқыған бөлшектерді агрегатты тұрақсыз күйге айналдыратын органикалық коагулянттар (желатин, казеин, т.б.) немесе коллоидтық құрылымдарды бұзуға және ірі тұнба түзуге жәрдемдесетін флокулянттар (метилцеллюлоза, пектиң, натрий альгинаты және т.б.) қолданылады.

Ауырлық күші әсерімен тұндыру немесе тұнбаға түсіру ағынды суларды тазартқанда, лайды концентрациялағанда байқалады.

Сепарация. Центрифугадан өткізу микробтық клеткаларды культуралдық сұйықтықтан бөліп алуға мүмкіндік береді. Центрифугалардың сан алуан түрлері бар: фильтрлеуші, тұндырушы, универсалды мөлдірлеуші.

Егер бөлінетін клеткалар диаметрі үлкен, олардың тығыздығы мен сұйықтық тығыздығы арасында үлкен айырмашылық болса, культуралдық сұйықтықтың жабысқақтығы төмен болса, ротор айналуының бұрыштық жылдамдығы жоғары болса, және центрифугалау радиусі үлкейгенде центрифугалау өнімділігі анағүрлым жоғары болады.

Культуралдық сұйықтықты фракциялау үшін әр түрлі конструкциялы сепараторлар қолданылады.

Тұндырушы сепаратор - бұл реактордың айналуының жоғары жылдамдығымен (12000 айн/мин) сипатталатын және тәрелкелі барабанмен жабдықталған центрифуга (19-сурет).

Аппаратта қуысты білік, қозғалмайтын корпусы бар. Корпуста айналмалы конустық тәрелкелер бір-бірінің үстінде конустық кеңістік түзе орналасқан. Культуралдық сұйықтықтың төменгі тарелка үстімен қуысты білік бойынша кіріп, корпустың сыртқы цилиндрлік шетіне жетеді. Одан кейін сұйықтың конустық тарелкалар арасымен орталық коллекторға жиналып, одан сұйықтық шығады. Қатты бөлшектер айналу орталығымен лақтырылып, тарелкалардың конустық корпустың бүйір қабырғасына түседі. Онда биомасса жиналады, корпустың төменгі жағынан қоюланған микробтық масса қысыммен түтік арқылы шығады. Оның концентрациясы құрғақ салмақтың 10-15% дейін құрайды.

Дезинтеграция. Клетка ішілік метаболиттерді бөліп алуда микроорганизмдер клетка қабырғасын бұзатын химиялық, ферментативтік және физикалық әдістер (дезинтеграция) қолданылады.

Клетка қабырғасына физикалық әсерді шыны немесе полимерлі, диаметрі 0,3-0,5 мм болатын дөңгелектер (дөңгелек диірмендер) көмегімен жүзеге асырады. Олар микроорганизмдер суспензиясымен айналмалы камераларда араласады да, езу, уату жолымен клетка қабырғасын бұзады.

Жиілігі 15-25 Гц болатын ультрадыбыс толқындарымен әсер ету (ультрадыбысты дезинтеграция) кең қолданылады.

Қысым мен температураны локальды өзгертетін соққылық толқындар клетка қабырғасының бұзылуына әкеп соқтыратын резонирлеуші нәтиже (кавитация) тудырады.

Клетка қабырғасының бұзылуына әкеп соқтыратын микробтық клеткалар суспензиясын бірнеше рет мүздатып-жібітуді қолдану да сирек емес.

Химиялық заттар (сілтілер мен қышқылдар ерітінділері, органикалық ерітінділер, детергенттер) клетка қабырғасының өткізгіштігін арттырады, оның бүтіндігін бұзады.

Микробтық клеткалардың ферментативтік лизисі протеазалар, пектиназалар, басқа гидролиздік энзимдер әсерімен жүзеге асады.