24 Билет

1Эмбриондар сапасын анықтау. Эмбриондардың сапасын балауда нақты белгілі меже болмағанымен, келесі тәсілдерді қолданылады; а) визуалдық морфологиялық бағалау, б)тірі күйінде бояу, в) цитогенетикалық және цитогистологиялық бағалау.

Негізінен эмбрионның сыртқы және ішкі морфологиялық күрылысына қарай – визуалды, яғни сыртқы қабатының, целлюцид бүтіндігіне, аймақтарының ішкі бластомерлердің толықтығына, даму кезеңінің ұрық жасына дәлме дәл келуі қарай анықтайды. Бүрісіп, жыртылып ыдырай бастаған эмбрион жарамайды.

Көшіріп қондырылатын эмбриондар сапасын - тіршілік қабілетін анықтауды in vivo және in vitro өткізеді.Бұл өте күрделі, толық стерильді ортаны талап ететін тәсілдердің бірі. Өсіруді бір тамшы қоректік орта құйылған пластикалық шәшкелерде, белгілі газдық ортасы бар, минералды май қабатының астында жасайды. Осы кезде ұрықтың даму қарқындығы тежеледі, ал 24-48 сағатта потенциалды өміршеңдігі жоғары жасушалар бөлініп үлгермейді де кейбіреулеріне орта жағдайы жақпағандықтан бөлінулерін тоқтатады.

Бекітілген препараттарда ұрық сапасын анықтаған кезде жасушаның биологиялық сапасы болып табылатын, құрылымының нәзік ерекшеліктерін анықтауға мүмкіншілік береді (ядро,цитоплазма).

Визуалдық бағалауды Петри шәшкелеріне цилиндрдің түбіндегі тұнбадан бөлшектеп құйып алып МБС-9, МБИ-13 микроскоптармен 50 рет үлкейтілген жағдайда эмбриондарды іздеп тауып балай бастайды. Негізінде бұл көрсеткіштің сапасы төмен: Бұл тәсіл арқылы, эмбриондардың тіршілік қабілетін, бірден эмбрион жасушасының зақымдалуы мен дамуы үрдісінің тежелуін жіктеп сараптамадан өткізіп - өте жақсы, жақсы, қанағаттанарлық, нашар деп бағалайды. Аталған балау бойынша сиырлардың төлді болуы да 63, 58, 31 және 12 % тең болады

Ұрықтың тіршілік қабілетін бағалау кезінде қолданылатын бояу - Эванс көгілдірі, эозин, метилен көгі ж т.б. Бояған кезде, бояулар өлген не өлім халындағы жасушаның мөлдір қабатынан өтіп, протоплазмасын бояйды.

2 Соңғы жылдары биотехнологияның үлкен өріс алуы генетикалық жаңа жетістіктеріне байланысты.Нақты айтқанда, қазіргі биотехнологияның көптеген салалары генетикалық инженериямен, әсіресе ген инженериясымен тікелей немесе жанама байланысқан. «Биотехнология» ұғымының өзі генетикалық инженерияның қалыптасуна байланысты пайда болды және алғашқы кезде бұл екі ұғым синонимдер ретінде қаралды.Алайда, уақыт өткен сайын бұл ұғымдардың мазмұны әр түрлі толықтырылды, дегенмен генетикалық инженерия биотехнологиягың құрама бөлігі болып қалды. Генетикалық инженерия жаңа генетикалық қасиеттері бар организмдерді құрастыру тәсілдерін жетілдіретін ғылыми өрістің саласы болса,ал биотехнология - өндірістің саласы. Генетикалық инженерия әдісі арқылы құрастырылған жаңа организм биотехнологиялық өндірісте қолданылуы мүмкін. Бұл генетикалық инженерия мен биотехнологияның арасындағы ортақ жанасу нүктелерін сипаттайды, мұндай байланыстың аяғында жаңа сапалы нәтиже пайда болады. Көптеген ғылыми жетістіктерін биотехнологиялық өндрісте пайдалану жаңа сапалы нәтижеге әкелмейді, сондықтан да олар биотехнологияның саласы бола алмайды.

Бұл курстық жұмыстың мақсаты мен міндеті, биотехнологияның генетикалық инженерия саласынан толығырақ мәлімет алу. Қазіргі кезде қолданылып жатқан жаңа технологиялармен танысу және қолданыста игеру.

3 Ферментациялық технология кезінде бүтін тірі жасушаларды (микробтардың, жануарлар мен өсімдіктердің жасушалары) немесе органикалық заттарды физикалық және химиялық жолмен айналдыру мақсатында қолданылатын қандай да бір жасушалық компоненттерді (мысалы ферменттер) пайдалануға болады. Алайда қажетті заттарды алуда қолданылатын әдістердің тиімділігі төмен, соңдықтан қажетті өнімдерді алуда қолданылатын технологиялық әдістердің тиімділігі неғұрлым жоғары болуы керек.

Органикалық өнімдерді химиялық әдістерге қарағанда биотехнологиялық тәсілдермен өндірудің артықшылықтары:

• ақуыз және антибиотиктер сияқты көптеген күрделі органикалық молекулалар химиялық тәсілдермен синтезделмейді;

• биоконверсия мақсатты өнімнің көп мөлшерде шығуын қамтамасыз етеді;

• биологиялық жүйелер төменгі температура, жоғарғы рН маңызын реттеп отырады;

• химиялық катализдік реакцияларына қарағанда биологиялық катализдік реакциялары неғұрлым телімдірек болады;

• биологиялық үрдістер бір типті таза изомерлі өнімді алуға мүмкіндік береді, ал химиялық синтездің реакцияларында өнімнің құрамында басқада қажетсіз заттар синтезделуі мүмкін.

Биолгиялық тәсілдердің химиялық әдістерге қарағандағы кемшіліктері:

1. Биологиялық жүйелер тез және оңай бөгде микрофлоралармен залалдануы мүмкін.

2. Биологиялық тәсілмен синтезделген мақсатты өнім күрделі қоспадан тұрады, сондықтан оны керек емес заттардан тазалап бөліп алу қажет.

3. Биотехнологиялық өндірісте көп мөлшерде су жұмсалады, нәтижесінде жұмасалған су сыртқы ортаға шығарып тасталынады.

4. Стандартты химиялық үрдістермен салыстырғанда био үрдістер баяу жүреді.

Әр биотехнологиялық үрдістің өзіне сәйкес қалыптастырылған схемасы болуы керек, ал ондағы жүретін үрдістер үнемі бақылауда және қадағаланып отыруы қажет.

Ферментациялық технология өндірістік деңгейде микробтық синтез және ашыту процестерінің нәтижелерін жүзеге асырады:

• ферментация микроорганизмдердің биореакторларда өсуі мен көбеюіне негізделген және микроорганизмдер биомассасын немесе метаболиттерін (антибиотиктер, амин қышқылдары және т.б.) алуды мақсат етеді;

• ферментация микроорганизм (продуцентті) қоректік ортаға себуден басталып қажетті өнімді алуға, оны бөліп алуға және тазартуға дейін созылатын, белгілі реттілікпен өтетін технологиялық процесс болып табылады;

• ферментациялық процесті іске асыруына үш объект қажет: микроорганизмдердің (продуценттердің) таза өсінділері, көп компонентті қоректік орта және автоматты басқару мен бақылау блогі бар биореактор.

Қажетті өнімнің саны мен сапасы продуценттің биологиялық қасиеттеріне, субстраттың қоректік құндылығына және технологиялық процестердің инженерлік орындалуына тәуелді болып келеді.

Ферментациялық процесс зертхана жағдайында колбаларда продуценттерді өсіруден басталып үдемелі мөлшерде зертханалық және тәжірибелі-өндірістік биореакторларға қайта себуге ауысады. Себілетін материал саны қоректік орта көлемінің 5-10%-на дейін жеткізіледі. Себілген культурадағы микроорганизмдердің өсуін анықтау үшін, 1 мл ортадағы саны есептеледі, культураның тазалығы тексеріледі.

Сонымен қатар, кейін биореакторға енгізілетін культуральдық орта (субстрат) дайындалады. Культуральдық ортаның құрамы продуценттің зат алмасу процестерінің ерекшелігіне байланысты түрде таңдалады. Ортаға қажетті жағдайда мақсатты өнімнің бастауыш заты, микроорганизмдердің өсуіне, дамуына керекті стимуляторлар енгізіледі.

Ферментация. Қолданылатын микроорганизмдер тобына (бактериялар, актиномицеттер, мицелилі саңырауқұлақтар), алынатын өнімге (микробтық биомасса немесе олардың метаболиттері), байланысты ферментация процестерінің технологиясы, динамикасы, аппараттармен жабдықталуына байланысты:

• периодтық, үздіксіз және қоректік ортаны оқтын-оқтын қосумен өтетін;

• беткейлік және тереңдік, сұйық және қатты фазалы;

• аэробты және анаэробты ферментация болып ажыратылады.

Периодтық ферментация кезінде алдын-ала залалсыздандырылған биореактор жабық жағдайда гомогенизацияланған, компоненттік құрамы бойынша дайындалған, залалсыздандырылған қоректік орта мен себілетін материалдармен толтырылады. рН, температура, қажет болған жағдайда белгілі мөлшердегі аэрация және араластыру бекітіледі. Ферментация процесі біткен соң, биомассаны биореактордан шығарады. Ферментерді жұмысқа қайта дайындайды, залалсыздандырылады да, процесс қайталанады.

Егер периодтық ферментацияда микроорганизмдер ферментация барысында культуралдық орта жаңартылмай өсірілсе, онда субстратты қосумен өтетін мерзімді ферментацияда культураға оқтын-оқтын түрде белгілі мөлшердегі жаңа қоректік орта қосылып отырады. Егер процесс көп компонентті орталарда (меласса, жүгері экстракты, целлюлоза мен белокы бар әр түрлі заттар) жүргізілсе, онда қосымша қоректендіруді толық ассимиляцияланатын субстраттармен (сахароза, спирт, т.б.) жүзеге асырған жөн. Бұл мақсатты метаболит өнімін арттыруға мүмкіндік береді. Процесс біткен соң, биомассаны өңдеуге жібереді.

Үздіксіз ферментация кезінде жаңа қоректік орта үздіксіз, белгілі жылдамдықпен биореакторға құйылады да, аппараттан сондай мөлшерде культуралдық сұйықтықты немесе биомассаны шығарып отырады. Микробты клеткалар субстрат компоненттерінің концентрациясы, продуценттің меншікті өсу жылдамдығы периодты ферментацияға қарағанда тұрақты. Ферментацияны аэробты жағдайларда (биомассаны өсіру, антибиотиктер, амин қышқылдары, т.б. синтезінде) іске асыру үшін қарқынды аэрация және культуралдық сұйықтықты араластыруды, қатаң асептикалық жағдайларды, уақтылы көбікті басуды, т.б. қамтамасыз ету керек. Технологиялық процесс жалпы мынаған бағытталған:

• микробтық клеткалардан СО₂ әкетіп, О₂-мен қамтамасыз ету (аэробтар);

• культуралдық сұйықтықты қарқынды араластыру. Бұл гомогенизацияны, нутриентердің, микробтық клеткалар мен О₂-нің биореактор бүкіл көлемі бойынша біркелкі таралуын, іркілген өңірдің болмауын қамтамасыз етеді;

• биореактор мен онымен байланысқан коммуникацияның стерилизациясын жүзеге асыру, асептикалық жағдайды қамтамасыз ету;

• ферментациялық процесті бақылау және басқару жүйелерін автоматтандыру.

Анаэробты жағдайда ферментация этанолды, шарапты, органикалық қышқылдарды, сыра алуда және т.б. ашыту процестерінде жүргізіледі. Бұл жағдайдағы технологиялық процеске деген талаптары өзгеше:

• араластырудың ферментациялық процесс динамикасына әсері шамалы. Ол ашушы сұйықтықты, көрсеткіштер ретінде рН, температура, т.б. пайдаланып, гомогенизациялау үшін қажет;

• көптеген жағдайларда монокультураның өсуін қамтамасыз ету анағүрлым жеңіл, демек, залалсыздандыру мәселесі басты емес;

• көбік негізінен СО₂-нің шығуына байланысты пайда болады, оны басу оңай;

• шарап, сыра, т.б. ашыту өнімдерін өндіруде бірінші орынға жоғары өнімділігіне қарағанда олардың дәмдік қасиеттері шығады.

Сондықтан процестің қарқындылығына қолданылатын құралдарды таңдау әдетте өзекті емес.

Продуценттерді өсіруді беткейлік және тереңдік әдістермен жүргізуге болады.

Тереңдік әдіспен микроорганизмдерді сұйық қоректік орталарда өсіреді, бұл әдіспен аэробты және анаэробты микроорганизмдерді де өсіруге болады.

Беткейлік әдіспен микроорганизмдердің аэробты дақылын өсіруге болады. Әдетте тығыз ортада, кейде сұйық орталарда өсіреді.

Қатты фазалы ферментация мицелилі саңырауқұлақтарды өсіргенде кең қолданады. Субстраттық беттің жеткілікті ылғалдылығы, орта құрылымының қопсымалы болып, дақылдың бетін О₂-мен қамтамасыз етуі және СО₂ әкету үшін аэрациялау қажет. Мицелийдің қарқынды өсуі үшін оған жылы ауа үздіксіз берілуі тиіс. Қатты фазалы субстрат өсіруші камераға орналастырылады, субстрат қабатының қалыңдығы 200-300 мм аралығында және технологиялық ерекшеліктерге тәуелді. Өсіру камералары тік және көлденен секциялармен қатты фазалы ферментацияға арнайы құрастырылған аппараттарда орналасады.

Идиофазада екіншілік метаболиттер жиналады, спора түзілу процесі жүреді, ферментация процестері аяқталады. Мақсатты өнім мицелийден бөлініп алынады, өсіру камералары қоректік орталардан тазартылады, залалсыздандырылады, жаңа қоректік ортамен толтырылады, саңырауқұлақтар спораларымен себіледі де, процесс қайталанады.

Ферментацияның сұйық субстраттардағы беткейлік тәсілі желдетілетін ауа камераларына орналастырылған қоректік ортасы бар кюветаларда жүзеге асады. Микроорганизмдер дақылы бұл жағдайда сұйық бетіндегі жұқа қабат түрінде немесе қалың қабат түріндегі биомассаны түзеді. Дақыл оттегіні тура ауадан алады, продуцентті өсіру үшін кең өндірістік алаң керек. Сонымен қатар, өндіру процесінің төмен өзіндік құны және төменгі энергия сыйымдылығы органикалық қышқылдарды (лимон, итакон) және басқа өнімдерді өндірістік көлемде алуға мүмкіндік береді.

Тереңдік өсіру биореакторда, асептикалық жағдайда, ортаны интенсивті аэрациялаумен жүзеге асады. Масса алмасу үш фазалы жүйеде өтеді: сұйықтық - тығыз қоспа (микробтық клеткалар) - газ. Бұл фазалардың бір-біріне әсер етуінің оңтайлы жағдайларын жасау үшін, ферментациялық процестің түрлі аппараттармен жабдықталуы қажет. Ол биореакторда гидродинамикалық процесті реттеуге келіп түйіседі: сұйықтықтың, жылудың, газдың мөлшерлі құйылуы мен әкетілуі, микроб/субстраттық әсерлесуді қамтамасыз ету үшін тұрақты гомогенизацияланады; өсіру ортасының физикалық-химиялық параметрлерін қадағалау және басқару (рН, рО₂, t°С, және т.б.).

Эукариоттық белокдарды (инсулин, интерферон, т.б.) түзетін рекомбинантты микроорганизмдерді қолданумен өтетін ферментациялық процесс сатылап екі биореакторда өтеді. Алдымен рекомбинантты микроорганизмдердің биомассасы бірінші реакторда ұлғайтылады, кейін биомасса технологиялық параметрлері басқаша екінші реакторға ауыстырылады. Өзгерген жағдайларда рекомбинантты белок синтезінің индукциясы жүреді. Клондаған гендер индукциясы мен экспрессиясы әдетте клеткалар өсуінің экспоненциалдық фазаның аяғында сәйкестендіріледі.

Неліктен рекомбинантты белок синтезінің тұрақты экспрессиясында ферментациялық процесті бір реакторда жүргізу тиімсіз? Бұл жағдайда үздіксіз транскрипция мен трансляция кезінде продуценттің энергетикалық қоры бітіп, өсуі баяулайды да, мақсатты өнім синтезі кемитін болып шықты.

Екі биоректорлардағы үздіксіз ферментация сонымен қатар микробтық метаболиттерді алуда қолданылады, яғни екі кезеңді хемостат. Бірінші аппараттан шыққан орта екіншісіне өтеді. Сонымен қатар, екінші аппаратта жаңа субстратпен қосымша қоректендіру жүреді. Көптеген жағдайларда бірінші реакторда биомассаның қарқынды жиналуына жағдайлар жасалынады да, екіншісінде мақсатты өнімнің биосинтезі жүреді.

Ферментацияның нәтижелігі. Микроорганизм дақылының өсу мен даму динамикасында продуценттің қоректік ортаның компоненттеріне, аэрация деңгейіне, рН-тың оптимальды көрсеткіші, температуралық режим және т.б. сұраныстары өзгереді. Бұл процестерді үйлестіріп реттеу - био өнімді максимальді өндірудің жағдайын жасаудың кепілі.

рН

Беткейлік өсіру кезінде орта рН-ының биосинтез процесіне әсері төмен болады, өйткені ол қоректік ортаның жоғары буферлігі және ылғалдығы аздығынан өзгермейді, тереңдік өсіру ортаның рН шешуші роль атқарады, ол залалсыздандыру және әсіресе өсіру процесі кезінде өзгереді.

Саңырауқұлақтар мен ашытқылар үшін рН – 3,8-5,6, бактериялар үшін - 6,2-7,4, клеткалық метаболиттер культуралдық ортаға түсіп рН-ты айтарлықтай өзгертуі мүмкін. Қолайсыз рН-тың өзгеруі алдымен биосинтездік ферменттердің белсенділігінде, мақсатты өнім тұрақтылығында байқалады.

Аэрация

Оттегі продуцент - аэробтың өсуі мен көбеюіне қажет. Аэрация залалсызданған ауаның қоректік орта қабаты арқылы барботирлеумен (желдету) қамтамасыз етіледі. Оттегінің біркелкі таралуына және көпіршіктің дисперсиялануына араластыру жәрдемдеседі.

Оттегі нашар ериді, клеткалармен жылдам' пайдаланылады, сондықтан аэрацияның үздіксіздігі және жеткілікті болуы маңызды. Аэрация микроорганизмдер өсуінің экспоненциалды фазасында, биомассаның ұлғаюында анағүрлым қажет. Оттегіге мұқтаждық стационарлық фазада, екінші метаболиттер өндірісі ұлғайғанда төмендейді.

Температура

Биопродуценттер негізінен мезофилдерге жатады: саңырауқұлақтар – 22-23°С, бактериялар 35-37°С. Температуралық режим ферменттердің катализдік активтілігіне, жылу алмасуға, қоректік ортаның тұтқырлығына әсер етеді. Егер температура оңтайлықтан төмен болса, микроорганизмдер өсуі баяулайды, метаболизм қарқындылығы төмендейді. Егер, керісінше температура жоғары болса, белокдар синтезінің индукциясы ерте өтуі мүмкін.

Көбік басу

Аэрация және интенсивті араластыру жағдайында көбік көп түзіледі. Артық көбік биореактордың пайдалы көлемін азайтады, культуралдық ортаның бөтен флорамен контаминациясына ықпалын тигізеді. Көбік термодинамикалық тұрғыдан тұрақсыз: ескі көпіршіктердің жарылып жаңа көпіршіктердің түзілуі үнемі болып тұрады. Көпіршіктердің жарылу процесін тездету үшін механикалық құралдар немесе химиялық көбік басушылар кіргізіледі. Бірақ, көбік басушылардың артық мөлшері масса алмасу процесін, оттегін клеткаларға тасуды бұзуы мүмкін.

Біркелкі өндірістік шығындарда ферментация нәтижелігі немесе мақсатты өнім шығымдылығын арттыру, өсіру динамикасындағы тиімді басқару, физикалық-химиялық параметрлерді реттеу арқылы жүзеге асады.

Биотехнологиялық процестің табиғи өнімділігі қоректік ортаның оңтайлы құрамына, С, N, Р көздерінің артықшылығы немесе лимитациясына, мақсатты өнімнің бастауыш затына байланысты.

4.Өсімдік ұлпаларымен және жасуша культураларымен жұмыс атқару барысындағы залалсыздандыру әдістері. Ыдыстарды, құрал-саймандарды, материалдарды және ламинар-боксты залалсыздандыру. Қоректік орталарды залалсыздандыру туралы түсінік: автоклавтау, салқын залалсыздандыру.

Лабораторияның құралдары мен жабдықтары зерттеу жұмыстарына бағытталған болу керек. Барлық лабораторияларда қоректік орталарды дайындау мен тканьдерді өсіру жұмыстары асептикалық жағдайда жүргізілу керек. Лабораториядағы бөлмелер мен тканьдерді культивациялау жұмыстары барлық талаптарға сай болуы шарт. Мұндай лабораторияларда келесі арнайы бөлмелер болады:

1. Ыдыстарды жуу бөлмесі. Бұл бөлмеде ыдыстарды жұмысқа дайындау – ыдыстарды жуу және оларды кептіру жұмыстары жүргізіледі. Көлемді жұмыстарды атқару үшін бөлмеде төрт немесе одан да көп мойкалар, ыстық және суық су құбырлары, сонымен қатар дистилденген су шығаратын қондырғы болады. Ыдыстарды жуатын үлкен раковиналар және төсеніштермен қамтамасыз етілген болуы қажет.

2. Қоректік орталарды, инструменттерді, материалдарды стерильдеу бөлмесі. Бұл бөлмеде горизантальды және вертикальды автоклавтар, ыдыстарды құрғақ ыстық ауамен стерильдеуге арналған кептіргіш шкафтар болады. Бөлме жақсы вентиляцияланатын болу керек, ол үшін қабырғаның сыртынан сорғыш вентиляторлар орнатылады.

3. Қоректік орталарды дайындау және алынған нәтижелерді талдау бөлмесі. Бұл бөлме қоректік орталарды дайындауға және алынған нәтижелерді өңдеуге арналған. Мұнда әртүрлі таразылар (техникалық және аналитикалық), дистилденген, бидистильденген сулар, рН-метр, электрлі плиталар, су моншалары, тоңазытқыштар, химиялық үстелдер, реактивтер, қажетті саймандар және т.б. болады.

4. Стерильді жұмыстарды жүргізу бөлмесі (ламинарлық немесе микробиологиялық бокс бөлмесі). Бұл бөлмеде асептикалық жағдайлар сақталынуы қажет. Микробиологиялық бокста кіре беріс бөлмесі, яғни киім ауыстыру бөлмесі болады. Боксты бактерицидті лампалармен стерильдейді. Мұнда қажетті жихаздар ғана болу керек. Бокс қабырғалары кафельденген немесе су өткізбейтін материалмен қапталған болады. Бокс стерильді ауа жібергіш фильтр қондырғысы орнатылған болу керек. Сонымен қатар бокста ламинарлық шкафтар болады. Бөлме температурасы бір қалыпты болу керек.

5. Өсімдік жасушалары, органдар мен тканьдарды өсіру бөлмесі (қараңғыда – «өсінділік» және жарықта – «фактеростатты»). Тканьдерді өсіру үшін міндетті түрде термостатты бөлмелер, яғни қажетті температураны қалыпты жағдайда ұстап тұратын автоматты қондырғы (кондиционер) және жарықпен қамтамасыз етілуі режимдерін қадағалайтын қондырғы болады. Бөлменің көлемі орындалатын жұмысқа байланысты болады. Бұл бөлмеде колбаларды, пробиркалар штативтерін қоятын полкалар, стеллаждармен жабдықталуы керек. Бөлме қабырғалары, төбесі, едендері жеңіл жуылатын материалдармен қапталады. Бөлмені айына 1-2 рет дезинфекциялаушы ерітінділермен жуып тұрады. Тканьдерді жарықта өсіру үшін люменисцентті лампалар қолданылады. Стеллаждардағы лампалар вертикальды немесе горизонтальды орнатылады. Өсімдіктер клеткасы мен тканьдерін өсіру үшін климаттық камераларды да қолдануға болады. Бұл камералар температураны, ылғалды, жарықты реттеп тұратын автомат болады.

6. Өсімдіктерді жасанды жағдайларда өсіруге арналған бөлме. Бұл мақсатта теплицаларды, оранжереяны, климаттық камераларды қолданады.

Ыдыстар, саймандар, материалдар. Картопты in vitro жағдайында микроклональды көбейту кезінде қоректік орталарды дайындау, сақтау, өсімдіктерді өсіру үшін химиялық ыдыстарды, тканьдерді изоляциялайтын саймандарды, қосымша инструменттерді қолданады.

Химиялық ыдыстар: әртүрлі көлемдегі колбалар, өлшегіш цилиндрлер, химиялық пробиркалар, стакандар, әртүрлі мөлшердегі пипеткалар, Петри шынысы, воронкалар, шыны таяқшалар, фарфорлы стакандар, спирт шамдары.

Саймандар: пинцеттер, скальпельдер, шпательдер, қайшылар, лезвиялар, препаравальды инелер, автоматты дозаторлар.

Материалдар: мақта, алюмини фольга, орағыш қағаздар, целлофан, сүзгіш қағаздар, жіп.

Ыдыстарды өңдеу. Қоректік орталарды дайындауға, өсімдіктерді өсіруге арналған пробиркаларды міндетті түрде стерильдеу керек. Бұрын қолданылған ыдыстарды ыстық суға салып, жуып, сосын 30-60 минутқа хромпикке (4-5%-ті кали бихроматы + концентрленген күкірт қышқылы ерітіндісі) салып қояды. Хромпиктен соң ыдыстарды 10-15 рет кранның суымен шаяды да, 3 рет дистилденген сумен шаяды. Сонымен қатар ыдыстарды әртүрлі детергенттермен де жууға болады. Пипеткалар мен өлшегіш ыдыстарды ауада кептіреді, ал қалған ыдыстарды кептіргіш шкафтарда 180-250^ОС-та ұстайды.

Қоректік орталарды, ыдыстарды, материалдар мен саймандарды стерильдеу. Өсімдіктерді өсіруге арналған ыдыстар қоректік орталар, саймандар міндетті түрде стерильді болуы қажет.

Шыны ыдыстарды және саймандарды құрғақ ыстық ауамен – кептіргіш шкафтарда 180-250^ОС-та 3-4 сағат бойы стерильдейді. Саймандарды пергамент қағаздарға орап, жіппен байлайды. Колбалар мен химиялық стакандардың бетін қағазбен немесе фальгамен жауып стерильдейді. Қосымша материалдарды – мақта, дәке, мақта- дәкелі қақпақшаларды пергамент қағазбен орап, 1 сағат бойы 2 атмосферада автоклавтау арқылы стерильдейді.

Қоректік орталарды қажетті мөлшерде ыдыстарға құйып, қақпақтарын жауып, 0,7-1 атмосферада (115-120^ОС) автоклавпен 20-30 минут стерильдейді.

Су мен тұзды ерітінділерді 1 сағат бойы 2 атмосферада автоклавтау арқылы стерильдейді.

Өсімдік материалдарын 0,1%-ті сулема немесе 0,1%-ті диоцид ерітінділерімен, сонымен қатар өсімдік тканьдерді 5-9 %-ті калий, натрий гипохлорит ерітінділерімен де стерильдеуге болады. Ерітінділерде стерильдену экспозициясы 15-20 минут. Сосын өсімдік материалдарын стерильді дистилденген сумен 3 рет шаяды.

Ламинарлық бокста жұмыс істеу үшін, аалдын ала спиртпен барлық ішкі жақ беттерін сүртеді. Қолды, барлық

5 Ин витро өсірілген кл.дың арасынан нақтылы бір селективтік жағдайға сәйкес өзгеріске ұшырап, пайдалы қасиетке ие болған кл.ды сұрыптап алуды кл.лық селекция дейді. Кез –келген өсімдік белогының амин қышқыл құрамын жақсарту үшін, тек аустырылмайтын амин қышқылдарынан тұратын(лизин, треонин, метионин) бұрын соңды болмағанғ қолдан жасалған табиғатта кездеспейтін полипептидтерді кодтайтын жаңа гендерді пайдалануға болады.

Қазіргі кезде бұрын қолданылған экологияға қауіпті, сүтқоректілерге улы гербицидтердің орнына жаңа, қауіпсіз герб.тер пайдаланылады. Бірақ олардың да кемшіліктері бар. Олар арам шөптерді жоюмен қатар екпе өсімдіктердің де өсуін тежейді.

Соңғы мақсат-гербицидке төзімділік белгісін гендік инженерия әдісін қолданып екпе өсімдіктерге енгізу. Әр түрлі химиялық қосылыстарға, соның ішінде гербицидтерге де, төзімділікті қамтамасыз ететін төрт механизм бар,.

1. тасымалдаушы- герб.тің кл.ға енуін тежейді

2. жоюшы- кл.ның ішіне кірген заттар клетка индукциялайтын факторлар әсерімен жойылады, көбінесе ол ыдыратушы ферменттер немесе улы заттар модификациялану арқасында зиянсыз затқа айналады.

3. Реттеуші- гербицид әсерімен инактивтенетін белок немесе фермент қайтадан қарқынды синтезделе бастайды, нәтижесінде қажет метаболиттің орны толады. Жанасушы- гербицид әсер ететін нысананың (белок немесе фермент) құрылымы өзгертіледі де, гербицид зиян әсер ете алмайды. Герби.ке төзімділік бір ғана генмен белгіленеді, яғни моногендік болады. Бұл жағдайда осы белгіні басқа өсімдікке рекомб.қ ДНК –ны қолданып енгізу жылдамдығын жеңілдетеді.

Фитотоксиндер белок синтезін тежейді, сондықтан зиянкес жәндіктерге,мо мен вирустарға қарсы қорғаныш болады.

Өсімдіктер қоршаған ортаның көптеген қолайсыз факторларының әсеріне тап болады. Өсімдіктің қандай болмасын стресс факторына төзімділігі көптеген генднрге байланысты. Мыс. Аязға төзімді ө.ді шығару үшін алу үшін ө.к мүшелерінің сыртына жабысып тіршілік ететін Pseydomonas syringae микробы қолдан.ды. Ол ерекше белок синтездейді. Ол белок сыртқы мембранады орналасқан. Суық түскен кезде осы белоктың айналасында мұз кристалдары тез п.б, ө.тің тамыры,саба,ы , жапырағында мұз қатып, ө.ті үсікке шолдыртқан. ал осы микробтардың сол белокты синтездеуге қабілеті жоқ мутанттары мұздың қатуын бәсеңдеткен,сондықтан мутант микробтары бар өсімдіктер үсікке төзімді болған.

Химиотерапия.Для освобождения растений от вирусной инфекции в ряде случаев ис­пользуют химические вещества - ингибиторы вирусов - соединения, замед­ляющие или подавляющие репродукцию вируса в клетках или передвиже­ние его внутри ткани для увеличения зон, свободных от вирусной инфек­ции. Данными веществами обычно обрабатывают ростки растений перед вычленением меристем или добавляют их в питательную среду, обрабаты­вают клубни, добавляют при корневых подкормках. В качестве ингибито­ров вирусов используют регуляторы роста: нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилмасляную кислоту (ИМК), гиббереллин, антибиотики,ферменты(в часности рибонуклеазы),продукты метоболизма дрожжей,грибов,бактерий и сок нек/х растений(жаньшеня алое и агавы), аминокислоты,нуклеиновые кислоты,красители,аналоги,пуриновых и пиримидиновых оснований (азагуанини,метилитозин)Эти вещества добавляют в питательную среду для выращивание меристемных растений.Эффективно используют при химиотерапии панкреатическую рибонуклеазу. Раствором рибонуклеазы конентраией 0,01-0,001%обрабатывают клубни в период проращивания, а также этиолированные проростки ,из которых вычленяют меристемы. Непосредственнуюобработку клубней ферментом можнопрогводить методом инфильтрации в вакуумной камере в течение20 минут, что приводитк большому расходу вещества. Поэтому эффективней добавлять РНК-азы в питательные для культивированияапексов. РНК-азы стимулирукт рост и развитие растений из апексов и ингибирует развитие вирусов. В результате применение такой технологии выращивание на10-35% повышается приживаемость меритстем на питательных средах, на 30-40% больше образуется растений регенирантов. Для повышения эффективности оздоровления исходного материала иногда сочетаются методы химиотерапии с термотерапией и методом верхушечной меристемы. Оздоровленные методом химиотерапии растения также требуют тщательной проверки на наличие вирусной инфеки Однако, при использовании этого способа необходимо помнить, что применение ингибирующих веществ без соблюдения соответствующих дозировок, учета кислотности среды, температуры соотношения с другими веществами может вызвать прямо противоположное действие. Кроме того, действие ингибиторов продолжается ограниченное время, по истечении которого вирусы снова начинают размножаться и распространяться по тканям растения. В связи с этим, химиотерапию можно рассматривать как эффективный вспомогательный способ при культуре меристем, способствующий увеличению безвирусных зон в апикальных зонах побегов растений.