20 Билет. 1 сұрақ. Биотехнологиялық өндірістің негізі ретіндегі микроорганизмдер- бактериялар мен актиномицеттерді, мицеллалы саңырауқұлақтар мен ашытқыларды, микробалдырларды.

Грациликуттер- клетка қабырғасы жүқа бактериялар, грам теріс-тер; фирмикуттер- клетка қабырғасы қалың бактериялар, грам оңды; тенерекуттер-грам теріс; клетка қабырғасы жоқ; мендозикуттер-клетка қабырғасының қүрылымы

Актиномицеттер - прокариоттар, клетка қабырғасы құрамында пептидогликан бар, бірақ олар көп клеткалы, күрделі даму циклді, спора, спора тасушыларды түзеді. Актиномицеттердің көптеген туыстығы мен түрлері аэробтар, сонымен қатар анаэробты, факультативті анаэробтылары да кездеседі, қоректік субстратқа талғампаз емес, тығыз қоректік ортада өскен кезде субстратты және ауалы мицелий түзеді, вегетативті жолмен көбейеді.

Ашытқы клеткалары - бұл бір клеткалы саңырауқұлақтар, 3 класқа бөлінеді: Аскомицеттер мицелий түзбейтін, клетка пішіні сопақша келген, диаметрі 3-15 мкм-ге жететін ашытқылар. Аскомицеттер бинарлы бөлінеді немесе аскоспорлар түзу арқылы жынысты жолмен (споралар арнайы клетка ішінде - дорбада немесе аскыда) бүршіктеніп көбейеді.

Базидиомицеттер - ашытқылар, базидиалы типті жынысты қүрылым түзеді (базидиоспоралар). Ол қызыл түсті ашытқылар Кһойозрогійіит туыстығы және қызғылт түсті - ЗрогоЪоІотусез туыстығы. Базидиомицеттер арасынан өндірістік штамдар жоқ.

Дейтеромицеттер ашытқы тәрізді саңырауқүлақтар, бүршіктеніп көбейеді, үштарында хламидоспоралары бар псевдомицелий түзеді (жіпше созылатын өспелі қүтышалардан клеткалар бүршіктенеді). Нағыз ашытқыларда (аскомицеттер) псевдомицелий және хламидоспоралары жоқ, тек аскоспора түзеді.

Саңырауқүлақтар спора арқылы жынысты және жыныссыз жолмен, вегетативті (бүршіктену немесе гифтер фраг-ментациясы арқылы) көбейеді.

Төменде генетикалық модификацияланған биообъектілер көр-сетілген:

- Е.сlоі - инсулин, соматотропин, интерферон синтезі;

- Аspergillus nidulans - интерферон;

- Ваcillus lichenoformis - интерлейкин;

- Хаnthomonas campestris - табиғи штамнан айырмашылығы кең қолданатын субстратта - сүттің сарысуында жақсы өседі;

- Sacch.cerevisiae- өсімдік ақуызының тауматит гені клондал-ған, сахарозамен салыстырғанда тәттілігі 3000 есе жоғары;

- β-глюканды ыдырататын β-глюконаза ферменті синтезін қада-ғалайтын ген экспрессияланған, нәтижесінде сыраны мөлдіретеді,

- крахмалды этанолға дейін ыдырататын штамдар гені клондал-ған (табиғатта - тек глюкозаға дейін);

- гепатит В-ң НВs антигені, ЖИТС вирусы қабығының ақуызы, гранулоциттердің колония ширатушы факторы, фибробласттардың өсу факторлары және тағы басқалардың синтезін кодтайтын гендер клондалған;

- Еrwinia herbicola - 2,5-дикето-Д-глюкон қышқылын 2-кето-Ь-гулон қышқылына дейін ауысуын қатализдейтін фермент синте-зіне жауапты Сorупеbасtеrіит sрр. генін клондады. Е.herbiсоІа табиғи штамы Д-глюкозадан тек 2,5-дикето-Д-глюкон қышқылын синтездей алады, яғни С витаминінің аралық өнімінің екі метаболизм реакциясын бір микроорганизмде біріктірілген.

3 сұрақ. Ферменттерді алу. Шикізат ретінде, азот және көміртегінің көздері ретінде крахмал, глюкоза, жүгері, бидай немесе балықтық ұн, казеин, аммоний тұздары пайдаланады.

Микрорганизмдердің биомассасы беткейлік (мицеллалы саңырауқұлақтар) немесе тереңділік дақылдандыру (бактериялар) жолымен артады. Әдетте бөтен микрофлораның түсуіне мүмкіндік бермейтін, залалсыздандыруды сақтап оқтынды тереңділік ферментацияны қолданады.

Ферментациялық үрдістің соңында ферментті тұрақтандыру, ақуыз молекулаларын бұзылуынан сақтау мақсатында ортаның рН тұрақтандырып, дақылдық сұйықтықты 5°С дейін тез салқындатады.

Одан кейін жогары жылдамдықта центрифугалап (сепарация) немесе тангенциальды фильтрден өткізген жағдайда дақылдық сұйықтық тығыз биомассадан ажырайды. Егер клеткадан тыс фермент болса, онда әрі қарай өңдеуде дақылдық сұйықтық түседі, егер клетка ішілік фермент болса, онда бөліп алу нысанасы ретінде клетканың массасы алынады.

Дақылдық сұйықтықты буланумен немесе ультрафильтрациямен концентрациялайды. Ферментті түрақтандыратын заттар қосады - ас түзы, бензоат, сорбинат және т.б. Ферменттің биологиялық активтігін жоғалтпау үшін сақтандыру қоспалар қолданады (8Н - цистеин, глутамин, меркаптоэтанол қосылыстары бар). Ферментті экстракциялау және тазарту барысында одан уыттық және жағымсыз метаболиттері, микроорганизмдері алынып тасталынады.

Одан кейін ферментті органикалық ерітіндімен (этанол, метанод ацетон, хлороформ, диоксан және т.б.), түздармен (аммоний сульфаты, натрий сульфаты немесе магний сульфаты, натрий ацетаты), сорбенттермен түнбалау немесе фракциялау арқылы бөліп алады.

Ферменттің тазарту дәрежесі оның қолдану мақсаттарына байланысты. Алынған экстрактіні диализбен, ультрафильтрациямен, мұздатумен тазартады.

Егер ферменттер клетка ішілік болса, онда биомассаны бөліп, клетканы ультрадыбыспен, шыны түйіршіктермен үгумен, мұздату-еріту жолдарымен бүзады. Клетка қалдықтарын центрифугадан өткізіп айырып тастайды, нуклеин қышқылдарды ферменттермен гидролиздейді немесе катион-полиэтилениминмен тұнбалайды. Ферменттің активтігі стандартталады.

Беткейлік дақылдандыру жағдайында субстрат ретінде соя немесе тары үны, сыра дайындау өндірісінен арпа ашытқысының өсіндісі қосылған дымқыл бидай кебектерін (56-65%) пайдаланады; рН 5,6-6,2; микроорганизмдердің аэрациясын және иммобилизациясын жақсарту үшін 10-20% қайыңның үгінділерін қосады. Дақылдандыру аяғында мицелийді бөліп алады, кептіреді, пигменттен ажыратады; ферментті органикалық немесе тұзды ерітінділермен экстракциялайды. Ферменттерді тереңділік тазарту жағдайында ультрафильтрация, аффинді және ионалмасу хроматография қолданылады; фермент лиофилизацияланады. Бұл ферменттік препаратты қолданудың басты мақсатымен байланысты.

Жануар шикізатынан ферментті бөлгенде, арнайы машиналар-ұсақтаушылармен, диспергирлеудің, үсақтау дәрежелерін қатал бақылауымен материалды ұсақтайды. Егер микроорганизмдер дақылынан ферментті сулы экстракциялаумен ажыратса, жануар тіннінен үш түрлі экстрагенттермен ажыратады:

- қышқылдардың сулы ерітіндісімен, рН 1,0-2,0;

- тұздардың сулы ерітіндісімен, рН 7,0-8,0;

- органикалық ерітінділердің (этанол, ацетон, глицерин) концентрленген сулы ерітінділермен.

Тағам индустриясында қолданылатын фермент:

- Амилаза көмегімен алынған көкөністер мен жемістер өнімдерінің қанты көп және жақсы сіңеді, әсіресе балалар үшін. Нан пісіруде амилазалар қамырдың жетілу үдерісін тездетеді және нан сапасын жақсартады. Сыра қайнатуда глюкоамилаза сырадан декстриндердің қалдықтарын алыптастау үшін пайдаланады;

- сахараза (инвертаза) - кондитерлік өндірісте қолданылады, сахарозаны глюкоза мен фруктозаға айналдырады; ол өнімде сахарозаның жоғары құнарлығында оның кристаллизациясының алдын алады;

- лактаза - лактозасы жоқ сүтті алуда пайдаланылады. Лактазамен өндегеннен кейін сүт жақсы дәмдік қасиетке ие болады. Одан басқа адамдардың біраз бөлігінде аллергиялық реакция тудыратын болғандықтан лактозасы бар сүтті іше алмайды;

- Пектиназалар бұл кешендерді бұзады, сығындыларды жеңілдетеді, жемістер мен жидектер шырынын мөлдірлетеді, жүзім, алмұрт, алма шырындарының шығымын арттырады. Пектиназаларды қолдану пектині көп жемістен шырынды өндіруде ерекше тиімді.

- протеазалар - сыра дайындау үдерісінде пайдаланылады: үлкен кезде ашытқыда сығындының шығымы мен аминдік азот деңгейін арттыру үшін және сыраның салкын түнбасын болдырмау үшін.

4 сұрақ. Рекомбинаттық микроорганизмдердің қатысуымен өтетін ақуыздардың өнеркәсіптік синтезі. Рекомбинанттьщ ДНҚ технологиясы мынадай: әуелі жасуша-донордан нативті ДНҚ-ны бөліп алу керек (клондайтын ДНҚ, кіріктіретін ДНҚ, ДНҚ-нысана, бөтен ДНҚ), одан кейін рестриктаза ферменттері көмегімен белгілі сайттарда оны қию қажет, бөлінген генді (гендерді) лигаза ферменттері іп vitro ДНҚ-ның рекомбинанттық молекуласы алады.

Осындай жолмен қүрастырылған рекомбинанттық ДНҚ-ны жасуша-реципиентке енгізеді, онда ол экспрессияланып, тиісті ақуыздардың синтезін кодтайды. Ақуыз өнімі бойынша немесе қажетті ген (гендер) жасушада анықтау арқылы клондау нәтижесін анықтайды.

5 сұрақ. Микроклоналды жолмен көбейтудің әдістері: төрт әдіс арқылы жүзеге асыруға болады:

1) өсімдіктегі меристемалардың дамуын белсендіру (сабақ апексі, сабақтың қолтық бұйыққан бүршіктері); 2) адвентивті бүршіктердің тікелей эксплант ұлпаларынан пайда болу индукциясы; 3) сомалық эмбриогенез индукциясы; 4) адвентивті бүршіктердің бастапқы және қайта отырғызған каллус ұлпаларынан мамандануы.

Микроклоналды көбейтудің мынадай артықшылықтары бар:

1. Бір өсімдіктен бір жыл ішінде миллионға жуық өсімдікті, ал қарапайым әдіспен тек 5-100 өсімдікті көбейтіп, алуға болады;

2. Аналық өсімдіктен алынған клондарды зертханалық жағдайда аз ғана жерде жыл бойы өсіруге болады және оларды белгілі бір уақытта шығаруға мүмкіндік береді;

3. Өсімдіктердің ауруларын туғызатын саңырауқұлақ, бактерия, вирус және нематодадан өсінділерді сауықтыруға болады;

4.Селекционерлерге өте бағалы, бірегей генотиптердің /линия, будан, мутант, трансгендік өсімдік/ көшірмесін қажетті мөлшерде алу мүмкіндігі;

5. Қалыпты жағдайда көбеймейтін немесе нашар көбейетін өсімдіктерді көбейтіп, тамырландыруға мүмкіндік береді. Мысалы, қылқан жапырақты орман ағаштарының таңдаулы түрлерін тез арада клонды тәсілмен көбейтуге болады.

2.Жәндік-зиянкестерге, вирустарға және гербицидтерге төзімді трансгенді өсімдіктерді алу. 1).Гербицидке төзімділік. Казіргі кезде глифосфатқа (раундап), сульфанилмочевинаға, фосфинотрицинге, триозинге төзімді сорттарды шығару дами түсті. АКДІ-та генетикалык инженерия эдісімен глифосфатқа төзімді темекі өсімдігі альгяды. Бүл гербицид амин қышкыддарьш түзетін ферменттің қызметін тоқгатады. Сондыктан бактерия геномынан (сальмонелладан) бөлінген генді темекіге енгізген. Енгізілген бөгде ген ферменттің жумысын жақсартьш, өсімдіктің гербицидке төзімділігін артырады. Бүндай тендер кызанакка, майбүршақка, мақтаға, терекке енгізгеннен кейін олар гербицидке төзімді болды. Тағы да бір бактерия геномынан бөлінген бөгде ген картоптың, кызанактың, темекінің геномьша енгізілді. Бүл әдіспен зияндылығы кеңінен таралған гербицидке (баста) төзімді өсімдіктер алынды. 2)3иянкестерге төзімділік. Ауыл шаруашылығында қолданылатын инсектицидтердің 40%-ті кабыршақканагшлар отрядына жататын жэндіктермен күресу үпгін пайдаланылады. 1985 жылы бактерия геномынан алынған протеинді түзетін ген темекіге енгізілді. Осындай жолмен алынған темекі өсімдігі бражник жүлдыз қүртына төзімді болып, бул белгі келесі үрпаққа беріліп тукым қуалайтыны аныкталды. Бүл өсімдіктердін зиянкестерден корғау тиімділігі 0,02% болды. Қазіргі кездегі жүмыстар осы технологияны жүгері, макта, көкөніс сиякты экономикалык манызды дакылдарға қолдануға бағытталған. 3) Ауруларға төзімділік. Қазіргі кезде гендердің, протеаза ингибиторларыньщ көмегімен жэне өсімдік жасушасының усыз заттарын антибиотиктер мен фунгицидтерге айнадцырады, хитиназа, глюканаза, ферментгерді таңбалайтын гендер арқылы өсімдіктерді патогенді микроағзалардан қорғау зерттелуде. Бактериялық аурулармен күрссу үшін павлиноглазка көбелегінде түзілетін ақ уыздарды қолдану мүмкіншілігі бойынша зертгеу жумыстары жасалуда. Павлиноглазка көбелегі куыршактары бактериялы ауруларға қарсы антибактериялық белсенділігі бар (аттацин, лизоцим) 15-20 ақ уыз түзеді. Бұл ак уыз гендері бөлініп толық зерттелген. Осы тендер енгізілген өсімдіктер, бактерияларға карсы ақ уыздардьщ түзілуі нэтижесінде, патогенді бактерияларға төзімді болады деген болжам бар. Корончатый галл ауруына төзімді гені бар темекі өсімдіктері алынды. Ол үшін өсімдік жасушаларына алькогольдегидрогеназаның ашыткы ферментінің гені енгізілді. Дәстүрлі селекциянын тиімділігі жеткіліксіз болғандыктан жэне вирус ауруларымен күресу агротехникалық құралдардың жоктығына байланысты өсімдіктерді вирус ауруларынан корғау жұмыстары жаңа технологияларды қолдануды қажет етеді. 4) Физиологиялық қолайсыз жағдайларға төзіміділік. Қолайсыз жағдайға төзімді өсімдіктер алу үшін жабайы өсімдіктердің жэне микроағзалардың гендерін қолдануға болады. Қазіргі кезде топырқтың қурғақшылығынан, кауіпті тұздарынан өсімдіктерді қорғайтын тендер аныкталды. Бул тендер тузға төзімді ағзалар жасушасында пролин амин қышқыльш түзіп осмос процесін ретгейді. Пролиннің түзілуін таңбалайтын ген ішек таяқшасынан алынды. Қолайсыз жағдайлардың біріне топырақ қурамындағы ауыр металдар жатады, эсіресе Cd металлы. Бүл металл өсімдіктің азотты сіңіруін, су жэне қоректік заттарды тасымалдау жүмыстарын тежейді. Канаданың өсімдіктерді зерттеу орталығында кадмийге төзімділікті таңбалайтын ген аныкгалды. Қытай атжалманы (егінді жейтін тышқан) геномынан алынған кадмийте төзімді ген вектор арқылы қыша өсімдігіне енгізідді. Трансформацияланған өсімдікте кадмий байланысу процесі 4 есе артга. Бүл жоғары сатыдағы өсімдіктерге сүтқоректілердің гендерін енгізу мүмкіншілігін көрсеткен алғашқы окиға. Үлыбританияда суыққа төзімді өсімдіктерді шығару жүмыстары жүргізілуде. Суыққа төзімділік белгісінің доноры бола алатын микроағзалар бар, мысалы, -5-тен +5°С дейін температурада өмір сүретін қар зеңін қуратын саңырауқулактар. Британиялық фермерлер үшін эдетте оңтүстік аймақгарда өсетін соя өсімдігін өсіруге мүмкіншілік беретін технология эзірленді. Бүл технология азық-түлік өңдірісінде революция жасай алады: коңыржай ендіктерде ашық жерде тропик өсінділерін өсіруге мүмкіндік туғызады. 5) Азоттың биологиялық сіңірілуінің тиімділігін жоғарлату және фотосинтезді күшейту. Қазіргі кезде азотты сіңірудің табиғи мүмкіншіліктері турғындардың өсуіне теңбе-тең азық-түліктің өсуін қамтамасыз ете алмайды - адамзаттың 30%-тен көбі жасанды азотты тьщайтқыштарынан тэуелді. Бірақ азотты тьщайткыштарды өндіру мен қолдануды одан эрі жетілдіру тиімсіз болып келеді, себебі азотты тьщайткыштарды химиялық жолмен өндіру үлкен энергия сыйымдылығын қажет етеді. Сонымен қатар бүл жағдай бір жағынан дүние жүзіндегі кайта жаңартылмайтын энергия ресурстарының шектелген корына, екіншіден ауыл шаруышылык өндірісін жүргізудің жаңа тэсілдері кезіндегі табиғи ортаның үлғайьш келе жатқан ластануына байланысты. Атмосфералық азотты микроағзалар арқылы сіңіру - өсімдікті байланған азотпен қамтамасыз етудің экология жағынан ең таза жолы. Биологиялык азот сіщру деп АТФ пен электрон донорларын талап ететін, азотты нитрогеназа ферментінің көмегімен аммонийге тотықсыздандыру айтады. Азотты симбиотихалық сіңіру бұршак тұқымдастардьщ тамыр түйнектерін түзетін бактерияларда жақсы зерттелді.

Қазіргі кезде азотты сіңірудің генетикалық жүйесі кеңінен зерттелуде. Бұл жүйе 8 оперонға (транскрипция бірлігіне) үйымдасқан 17 геннен түратыны аныкталды. Бактерия гендерінің екі жинағы теңестірілш, біреуі түйнектердің түзілуінін жалпы қызметін анықтаса, екінші жинағы белгілі бір қожайынға жауапты болады. Өсімдік гендердің өнімдері түйнектерді түзуге қатысатын бактерия гендерінің экспрессиясын ынталандырады, жэне де керісінше, бактерия гендерінің өнімдері кейбір өсімдік гендерін, мысалы леггемоглобин сияқты гендерді белсендетуге қатысатыны туралы деректер альшды. Нитрогеңаза ферменті оттегі қатысқан кезде төзімсіз екені белгілі. Леггемоглобин - түйнектерді толтыратын ақ уыз, ол оттегін байланыстырып, нитрогеназаны инактивациядан қорғайды. Бактериялардың азот сінірудің өнімділігі АТФ-ты тотыксыздандыратын гидрогеназа ферментінің бар болуынан тэуелді екені эксперимент нэтижесінде дэлелденді. Сондыктан гидрогеназаны таңбалайтын генді енгізу азотшң сіңірілу тиімділігін жақсартады. Биотсхнологияның көмегімен жаңа симбиотикалық жүйелерді қүрастыру арқылы азотты сіңіру мүмкіндіктерін кеңейтуге болады. Қазіргі кезде азотты сіңіру процесімен байланысты тендер бактерия генінен біртұтас бөлініп ішек таяқшасында көбейтілді. Осы гендерді эртүрлі эволюция деңгейіндегі ағзаларға көшіру мүмкіндіктерін аныктау жэне бөтен ағзада қызмет ету жағдайларын зертгеу жумыстары жалғасуда. Азотты сіңіру жүйесі өсімдіктен үлкен энергия шығынын талап етеді, сондыктан бүл жағдай өнімділіктің төмендеуіне экеліп соғуы мүмкін. Сонымен қатар нитрогеназаның өсімдік жасушаларынан бөлінетін оттегінің әсерінен тежелуін боддырмау мэселесін шешу қажет. Сол себептен азотты өз бетімен сіңіріп алуға қабілетгі астық дақылдарын алу одан да күрделі мэселеге айналыл отыр. Азот сіңіру гендерін қосымша гендермен бірге тікелей өсімдік хлоропластарға енгізу эдісі басқаларға қарағанда тиімдірек. Осыған байланысты прокариотикалык гендерді эукариотикалык ағзада дүрыс экспрессия мэселесі туындайды.

Астық дақыддарының өнімділігін фотосинтезді күшейту арқылы жоғарлатуға болады. С0₂ тотыксыздандырудың негізгі ферменті рибулезо-1,5-бифосфат-карбоксилаза (РБФК). РБФК ферменті екі қызмет атқарады: біріншіден фотосинтез процесінде көміртекті тотықсыздандырады, екіншіден фототыныс алу кезінде көміртекті тотыктырады. РБФК-ның бүл екі қарама-қарсы процеске қатысуы С0₂ жэне 0₂ концентрацияларымен реттеледі. Фотосинтез гендерін зерттеп жэне оларды бөгде ағзаға көшіру арқылы өсімдіктер өнімділігін жоғарлатуға болады. Бул бағыттағы зерттеу жүмыстары қазіргі кезде Австралия, Канада, АҚШ, Жапония елдерінде жүргізілуде. 6) Ак уыздың коректік қундылығын жаксарту. Генетикалык инженерия өсімдік ақ уыздарының саны жэне сапасы жағынан да тыңғылыкты генетикалык трансформация жасауға мүмкіндік береді. Ол үшін үш тэсіл үсынылады: тендер жасушасьша амин қышқылды күрамы бойынша толық күңды жаңа ақ уыздарды енгізу; қосымша тендер көшірмесін енгізу аркылы жасушада бар ақ уыз өнімін көбейту; ташпы амин кьппқылдары үшін жаңа кодондарды ендіру көмегімен кордағы ак уыздардың қурылымдык гендерін өзгерту.

Үрме буршақ, жүгері, арпа, бидай, буршақ тұқымдарының кор ақ уыздарьш таңбалайтын тендер көбейтідді зерттелді. Олар агробактериялардың Ті-плазмидаларынын негізінде векторлар көмегімен темекі мен петунияға тасымадданды.

Австралияда жоңышқа мен бедеге қүрамында күкіргі көп ак уызды енгізу мақсаты қойылды. Ол үшін альбуминнің қор ак уызының генін бүршақган жоңышкаға енгізіп, бүл геннің тукымда емес, жоңышқаның жасыл массасындағы экспрессияға қол жеткізідді. Осы жолмен Австралияда қой басын көбейтпей-ақ қой жүнін өндіруді 5%-ке үлғайтуға үміттенеді. Австралиялық койлардың негізгі азығы - жоңышка курамывда жүн түзуге қажетгі цистеин амин кышкылыньщ күкірт мөлшері аз, ал бүршақ альбуминінде ол көп. Ак уызда күкірті бар амин кышқылының доноры ретінде (метйонин жэне цистеин) бразилиялық жаңғағын колдануға болады. Оның гені ашыткы жасушаларында көбейтіліп, кызанак жэне темекі өсімдіктеріне тасымалданды. АҚШ-та күнбагас өсімдігіне векторлар көмегімен Ті-плазмиданың негізінде фасоль мен жүгерінің қордағы ак уыздары енгізілді. Картой өсіру жөніндегі Халықаралык орталықга (Перу) ауыстыруға болмайтын амин кышкылд арым ен байытылған синтетикалык ақ уыздарды таңбалайтын гендерді қүрастырьш, оларды картой өсімдігіне түйнектің коректік күндылығын жоғарлату үшін енгізді.

Гендерді осылайша тасымалдауда трансплантацияланған геннің үлпа ерекшелігі мэселесі алға қойылады. Фасоль генін тасымаддау нэтижесінде түзілген фазеолиннің темекідегі мөлшері өсімдіктін барлык бөліктерінде бірдей больш шыктьі жэне де өнім шығымы төмен болды (темекінін жалпы ақ уызьшан 1%-тен кем), ал фасоль өсімдігінде фазеолин түқымда ғана жинакталып, мөлшері ак уыздың жалпы санынан 50%-ке дейін жетеді. Совды жыддары векторлар курамына өсімдіктін анықталған органдары мен үлпасында гендердің жоғары тиімді айқындылығын камтамасыз ететін реттеуші тізбектерді енгізу жүмыстары орындадды. Темекіге енгізіжен фазеолин гені, түқымда ғана кызмет ететін промотор бақылауына альшып, нэтижесінде фазеолин тек туқымда ғана жинақтала бастады.

3.Культраларда жасушалардың өсуі. Жасушалардың өсу фазалары. Кульвирленетін жасушалардың өсуіне сыртқы және ішкі факторлардың әсері. Каллус ұлпасы жасуша өсіндісінде жоғары сатыдағы өсімдіктерде кездесетін жасушалардың мамандану қабілетінің жойылуына байланысты п.б. Каллус ұлпасы өте сирек жағдайда, өсімдік зақымданғанда пайда болады. Бұл ұлпа зақымданған жерді қорғап, мүшені қалпына келтіру үшін қоректік заттарды сол жерге жинайды. Арнайы ұлпа жасушаларының бөлінуге қабілеті пайда болған кезде каллус ұлпасы түзіледі. Жасуша зақымданғанда оның жауабы ретінде төзімділік пайда болады. Эксплант – каллус ұлпасын алу үшін қоректік ортаға отырғызылатын өсімдіктің алғашқы бір бөлшегі. Бірақ эксплант құрамында физиологиялық белсенді заттар аз болғандықтан каллус ұлпасы пайда болуы үшін қоректік ортаға қоздырғыш ретінде фитогормондарды қосады. Маманданған эксплант жасушаларын қоректік ортаға отырғызған кезде олардың зат алмасуында өзгерістер байқалады, бұл негізінен жасушалардың зақымданғаннан кейін бөлінуге дайындалғандығына байланысты. Болжамдар бойынша, жасуша зақымданған кезде олардың бөліну үрдісін ынталандыратын қоздырғыштар - элиситорлар түзіледі. Бұл зат жасуша қабығының полисахаридтерінің ыдыруынан пайда болады. Элиситордың арқасында маманданған жасушалар өз мамандығынан тез айрылып, белсенді гендердің өзгеру нәтижесінде қор заттардың жиналуына, пластид аппаратының қайта құрылуына, РНҚ –ның барлық түрлерінің және ДНҚ түзілуіне, антиген - ұлпа ақуызының жоғалуына және жасушаның бөлінуіне қажетті ақуыз пайда болады. Осы құбылыстардың нәтижесінде пайда болған каллус ұлпасы жұқа қабықты, әр түрлі көлемді паренхимдік жасушалардан тұрады. Бұлар созылу кезеңінен өтіп және жаңадан бөлінуге дайын жасушалар.

Каллус ұлпасы тығыздылығына байланысты борпылдақ, тығыз немесе орташа тығыз болады. Борпылдақ каллус тез өседі және сұйық орта /суспензия/ дайындауға қолайлы. Тығыз каллус ұлпасын екінші мамандану арқылы тұтас өсімдік алу үøін пайдаланады. Каллус пайда болуы үшін алғашқы кезде қоректік ортада ауксиннің мөлшері, оның өсу кезіндегі көрсеткішінен бірнеше рет жоғары болуы шарт. Мысалы, каллустың пайда болу кезінде ортаға 2-3 мг/л 2,4-D қосу қажет болса, ал оның өсуін қолдау үшін 0.5- 1.5 мг/л , D жеткілікті /эксплант түріне байланысты/.

Каллус ұлпасының өсуін сақтау үшін әрбір 4-6 аптадан соң ұлпаның бір бөлігін залалсыздандырылған жағдайда сақтай отырып, жаңа қоректік ортаға ауыстырады, бұл үрдісті көшіру немесе пассаж жасау дейді. Осылай каллус ұлпасын ұзақ уақыт /оншақты жылдар бойы/ сақтауға болады. (лпаны бірнеше рет пассаждан өткізуге/ көшіруге/ болады. Бірақ көп рет пассаждан өткен каллус “үйреншікті” жағдайға ұшырайды. Нәтижесінде гормондық тәуелсіздік пайда болып, каллус ұлпасының тұтас өсімдікті қалпына келтіру қасиеті жойылып кетуі мүмкін.

Өсудің жылдамдығына байланысты каллусты қайта отырғызуды /пассаждауды/ 28-30 күн сайын жүргізіп отырады. Өсіру кезеңі орташа  аптаға тең. Каллус ұлпасының жаңа қоректік ортаға қайта отырғызуға арналған бөлігін енді эксплант емес, оны трансплант деп атайды. Каллус ұлпасы пайда болу үшін эксплант ретінде өсімдіктің әр түрлі мүшесін: тамыр, өркен, жапырақ, тозаңқапты және т.б қолдануға болады Каллус алу үшін жетілмеген, жас ұлпаларды пайдаланған жөн. Мысалы, ұрықтанудан 8-10 күн өткен соң алынған жүгерінің эндосперм эксплантынан каллус пайда болмайды.

Алғашқы экспланттың өлшемі каллустың өсуіне әсерін тигізбейді, бірақ ең аз мөлшердің шегі болады, оны азайтқан жағдайда эксплантты өсіру мүмкін емес. Мысалы, сәбіз тамырының флоэмасынан алынған массасы 3,8 мг экспланттар өсуге жарамды болса, осындай мөлшерде жер алмұртынан алынған эксплант жарамсыз. Оның себебі сәбіз жасушалары ұсақ болғандықтан, эксплантты кескен кезде олар көбірек зақымданады.Каллус жасушалары өсу кезінде бөлініп, өсіп, маманданып, соңында өсуі тежеліп, тоқтайды. Каллус ұлпасының өсуі қалыпты жасушалар сияқты S- әрпі тәрізді сызба ңұсқасымен бейнеленеді (4-сурет). Әдетте, агарланған 20-40 мл қоректік ортаға отырғызылатын масса 60-100 мг тең.

Осы мөлшердегі экспланттың үлкен бөлігі 3-8 апта ішінде қайта отырғызуға жеткілікті каллус түзеді. Осы каллусты әрі қарай өсірген кезде, генетикалық және физиологиялық ерекшеліктері бар жасуша штаммы түзіледі.

Жеке жасушаның көзі ретінде қоректік ортада өсетін жасуша суспензиялары, бөлінген ұлпалар, жекеленген протопласттар есептелінеді. Жеке жасушаларды өсіру арқылы бір жасушадан түзіліп басталатын өсімдік клонын алуға болады. Егер өсімдік жасушасының каллусын тығыз қоректік ортаға жеке орналастырса, ол микроағзалар сияқты бөлініп колония құрмайды. Жеке орналасқан жасуша бөліну қабілетінен айырылады. Сондықтан жасушалардан клонды алу үшін мынадай тәсілдер қолданған жөн: “күтуші қабат” / культура няньки/, “қоректендіруші қабат” /кормящий слой/ және «микротамшыда» өсіру әдісі.

“Күтуші қабат” әдісінің мәні мынада - тығыз қоректік ортаға, жеке каллус жасушаларының арасына 4-5 мм қашықтыққа сол өсімдіктің, жылдам өсіп келе жатқан каллус ұлпасының бөлігін орналастырады. “Күтуші қабат” ұлпасы жеке жасушаның бөлінуіне, әрі қарай дамуына қолайлы жағдай туғызады. “Қоректендіретін қабат” құру үшін жекеленген жасуша алынған өсімдіктен немесе соған ұқсас өсімдіктен жасуша суспензиясын қолданады. Жасуша суспензиясы өсу кезеңінің алғашқы кезінде алынады. Аузы кең колбаға құйылған суспензияның бетіне орналасқан тор көмегімен жеке жасушалары бар сүзгіш қағазды 7 суретте көрсетілгендей бекітеді. Жеке жасушадан пайда болған клонның мөлшері 0,5-1мм болған жағдайда оны әрі қарай өсіру үшін агарланған қоректік ортаға ауыстырады.“Микротамшы” әдісін қолданған жағдайда жеке жасушаларды аз мөлшерде /1мкл/, яғни бір тамшы көлемінде, сұйық ортаға арнайы пластикалық ыдысқа орналастырады. Жасушаның өсуі микротамшылардың орналасу тығыздығына байланысты.

4.Витаминерді алудың дәстүрлі және жаңа технологиялары. Олардың биологиялық ролі және тағам өнеркәсібінде қолданылуы. 1930-1940 жылдары витаминді препарат ретінде клетка құрамында эргостерині бар нан ашытқыларын қолданған. Ашытқы биомассасын ультракүлгін сәулесімен өндеп эргосериннен Д–эргокальциферол алынған. Витамин С–ні сірке қышқыл бактериялар сорбозаға дейін сорбитті трансформациялау жолымен алады. технологиялары:

Өсімдіктер және жануарлардың шикізатынан витаминді препараттарды экстракциялауы (В₁₂ –ірі қара малдың шикі бауыры, каротин –сәбізден);

Химиялық синтез –витаминдер өндірісінің негізгі жолы;

Микробиологиялық синтезбен малдың жеміне қосылатын витамин концентратты (В₂, В₁₂) алынады;

Химиялық және микробиологиялық синтездерді үйлестіру (С және В₂ витаминдері);

Витаминдерді емдік препарат ретінде тағайындайды:

В₁ –антиневроздық, В₂ - өсіру витамині, В₆ –антидерматиттік, В₁₂ –анемияға қарсы, С –иммунитетті күшейтуші, А –антисклерофтальмиялық, Д –рахитке қарсы, Е –антиоксидантты, К –антигеморрагиялық; Ауыл шаруашылық жануарлардың, құстардың өсуін жоғарларту және тағамды тепе тенестіру үшін жемдік концентрат (В₂, В₁₂), тағамдық қоспа (Д), консервант (С) ретінде пайдаланады.

• Алыну технологиясына байланысты: 1-ші тип. Тағамдық көздерден немесе басқа да табиғи шикізаттан алынған витаминдер. Олардың молекулярлы, биологиялық және биохимиялық комбинациялары өзгертілмейді. Бұнда негізінен шикізаттан ылғал мен талшықтар ғана алынып тасталынады. Ферменттердің белсенділігін сақтау үшін витаминдер 44 градустан төмен температурада өндіріледі. Бұндай витаминді препараттар бұзылуына байланысты оларды төмен температураларда сусыздандырып, құрғату жолымен консервілеу қажет. Бұл витаминдердің өндірісі қымбатқа түседі.

• 2-ші тип. Фракционирленген витаминдер (қоспадан химиялық немесе физикалық әдістермен бөліп алу). Бұл витаминдер коллоидты емес, кристалды. Шикізатты дистилдейді, араластырады және шындығында, алғашқы өнімнің құрамындағы бүкіл элементтер өңделіп, жойылып болған соң, тек таза витаминдер ғана қалады.

• 3-ші тип. Синтетикалық витаминдер. Атынан белгілі бұл табиғи емес, құрамында микроэлементтері жоқ бұндай витаминдердің организм үшін ешқандай құндылығы болмайды. Айта кететін жайт, заттар 2 изомер (вариант) түрінде болады. Олардың химиялық формуласы бірдей, бірақ айналуы бойынша ажыратылады. Оңжақты және солжақты айналулар бар. Табиғатта витаминдердің молекулалары оңжақты айналымды, ал синтетикалық аналогтары – солжақты айналымды болып келеді. Синтетикалық витаминдердің өндірісінде белгілі бір себептерден дұрыс айналымды жасауға мүмкін емес. Сондықтан да мұндай витаминдерге қажетті ілеспелі заттарды қосуға мүмкіндік жоқ.

В₁₂ витаминінің азықтық концентратын (КМБ-12Н) өндіру кезеңдері:

• Метантүзуші бактериялардың мелассалық бардасын (қойыртпақты) ашыту;

• Метанды ашытқыны рН 5,5...6,5 дейін қышқылдау;

• Метанды ашытқыны буландыру;

• Кептіру;

• В₁₂ азықтық витаминін орау, буып-түю.

В₁₂ кристалдық формасын алу технологиясы. Кезеңдік тереңдік ферментация тәсілімен өндіруші P. Shermanii анэробты жағдайда жүгері экстракті, глюкоза, кобальт тұздары мен аммоний сульфаты бар субстратта 3 тәулік бойы дақылдандырады. Инкубация мерзімі аяқталғанда дақылы бар қоректік ортаға 5,6 –диметилбензимидазол (5,6 –ДМБ) қосады. Витаминнің концентрациясы 250 мкг/г жеткенге дейін тағы 72 сағат бастапқы зат қатысуымен ферментация жалғаса береді. Клеткада жиналып қалған В₁₂ 85ºС температурада рН 4,5 -5,0 сепарация және сумен экстаркциялау жолымен бөліп алады, экстрагенттен ақуыздарды тұнбалайды, ал сұйықтығын ион алмасу колонкалардан өткізеді. Колонкаларға адсорбцияланған В₁₂ ацетонмен элюацияланады, әрі қарай витаминді кристалдайды да витаминнің дәрілік формасын тағайындайды. В₁₂ витаминің алудың микробиологиялық үрдістерінің сипаттамасы.

В₂ витамин алу технологиясы. В₂ витаминнің алуының технологиялық процессі аэробты ферментация, термолиз және концентрлеу, кептіру мен грануллаға айналдыруынан тұрады. Ферментация стерильді жағдайда, тұрақты аэрация жасауымен 28 -30ºС температурада 60 -100м² көлемді ферметтерлерде жүреді. Субстарт ретінде сояның, балықтың және жүгері ұны, меласса, сүттің сарысуы, казеин, техникалық май, кальций карбонаты, бір ауыспалы фосфат калийі. өсіру стимуляторы ретінде биотин, тиамин, инозит қосады. Ферментацияның ұзақтығы 60-80 сағат, мицелийдің лизиске ұшырағанға дейін, саңырауқұлақтың спора түзуіне дейін рибофлавиннің концентрациясы 1200 мг/г барады.

Ферментация аяқталғанда дақылдық сұйықтықты мицелиймен бірге вакуум –кептіргіш аппаратқа салады. 80ºС температурада клетка құрлымдардың термолизисі жүреді және сусыздануы мен концентрленуі байқалады. әрі қарай сироп тәрізді массаны аэрозольмен кептіреді, ылғалдылығы 8% тең болу керек. Әрі қарай сироп тәрізді массаны гранулалар дайындалады, оларды толықтырады (1г концентратқа 15 В₂ келеді) жемдік қоспа ретінде қолданады. Медицинада қолданатын витамин В₂ әрі қарай тазартылады және кристалдайды. Витамин В₂ тағы химиялық синтезбен алады [3, 4].

А витамин (ретинол) алу технологиясы. Ретинолдың өнеркәсіптік өндірісі микробиологиялық және химиялық синтезбен өтеді. Микробиологиялық синтезі B. Trispora қолдануына негізделген, субстарт ретінде бидай немесе күріш ұны, өсімдік майы. Бета –каротин синтезі стимуляторы –В –ионон немесе цитрустық меласса және тиамин. Күн сәулесі осы пигменттің шығуын күшейтеді. B. trispora (+) және (-) штамдары бөлек қоректік орталарға егіледі, ферментация алдында оларды биореакторда араластырады. (+) және (-) штамдардың қатынасы 1/15 тең, яғни еркек формасы (-) 15 –еселік шектен тыс көп болуы. Әр түрлі жынысты аналық (+) және аталық (-) мицелийлері біріккенде зигота пайда болады, жеке штамдарға қарағанда 5 -17 есе жоғары бета –каротинді түзеді. Ферментация аэрация мен тұрақты араластырумен жүреді. Бета –каротиннің деңгейі -2000 мг/л жетеді.

Ферментация аяғында биомассаны сепоратордан өткізеді, аэрозольді кептіру жүргізеді, қалдық ылғалы 7% дейін болады. Қолдану мақсатына байланысты келесі технологияларды ажыратады:

«кептіргенне кейін ұнтақты толтырғышпен араластырады және грануллайды, жем концентраты ретінде қолданады;

«маймен экстракциялайды, концентрациялайды, этанолмен шаяды, каротинді майдан алады (күнбағыс немесе басқасы), онда провитаминнің деңгейі 2,0 -2,5 г/кг, нанға тағам қоспасы ретінде пайдаланады;

«кристалды бета –каротин –фреонмен экстракциялайды, органикалық қоспалардан тазартады, қызғылт сары түсті кристалдар алады, медициналық мақсатта қолданады.

Д витаминді алу технологиясы Эргостериннің алу көзі (эргоста -5,7,22 –триен -3β –ол) микрбалдырлар, зең саңырауқұлақтары және оларға аса бай ашытқылар. Сондықтан Д витаминді алу үшін алғашында микробиологиялық синтезімен ашытқылардың биомассасын жинайды. Кейін ашытқы суспензиясын немесе кептірілген ашытқы клеткаларын ультракүлгін сәулесімен өндейді, нәтижесінде эргостериннің фотохимиялық алмасуында эргокальциферол пайда болады.

Эргостеринді өндірушілер қатарында Saccharamyces carisbergensis, S. Сerevisiae, S. Еllipsides және басқа микроорганизмдер қолданады. Эргостерин бактерия клеткаларында өте аз мөлшерде түзеді. Эргостериннің бастаушы –сквален. Ашытқы клеткаларында сквалин синтезі дақыл картая бастағанда күшейеді және өсудің стационарлық фазасында жалғасады.

Ашытқылардың ферментациясы аэрация жағдайында және азот көзімен салыстырғанда көмірсулардың көздерінің шектен тыс асқанда іске асады. Алынған биомассаны тұз қышқыл ерітіндісіне гидролиздейді, кейін спиртпен тазалайды, концентрациялайды, 280-300 нм толқындар ұзындығымен ультракүлгін сәулесімен өндейді. Осындай сәулелер А және В көміртекті циклдарда химиялық байланыстарды қоздырады, нәтижесінде эргостин Д витмаинге айналады.

Витаминнің майлы формасын алу үшін өнімді фильтрациядан өткізгеннен кейін өсімдік маймен ерітеді және тағамдық қоспа ретінде пайдаланады. Кристалды витамин дайындау үшін қосымша тазарту жүргізіледі.

5.In vitro жағдайында гаплоидтерді алу технологиясы. Андрогенез, партеногенез. Өсімдік селекциясындағы гаплоидтердің маңызы. Селекция бағдарламасында гаплоидтарды қолдану:

1.Гаплоидтық өсімдіктердің жасушаларында хромосомалар жиынтығының жартысы ғана болады. Оларды гомозиготалық изогендік линиялар алу үшін пайдаланады. 2.Гомозиготалық изогендік линиялар хромосомалар саны екі еселенген кезде пайда болады да, гетерозистік будандар алу үшін қолданылады.

3.Изогендік линияларды гаплоидтерді екі еселеу арқылы бір жыл ішінде алуға болады, ал оны дәстүрлі инбридинг тәсілімен алу үшін 4-6 жыл кажет. 4.Айқас тозаңданатын өсімдіктерде гаплоидтік хромосома саны екі еселену арқылы өзіндік құндылығы бар таза линиялар алынады. Мысалы, осы тәсілмен алынған жүгері линиясының тұрақтылығы өте жоғары, инбридинг депрессиясы төмен. 5.Гаплоидтік жасушалар мен өсімдіктер рецессивті мутацияларды тез ажыратуға мүмкіндік береді. Мутагендерді пайдаланған соң, гаплоид ішінде рецессивті мутациялар анықталады, одан кейін бағалы мутанттық белгілері бар тұрақты линиялар алынады. 6. Гаплоидтік жасушалар мен өсімдіктерде рецессивтік мутациялармен бірге, гендердің сирек кездесетін рекомбинацияларын және енгізілген бөгде генетикалық материалдардың экспрессиясын тез арада анықтауға болады. Олар қалыпты диплоидтік өсімдіктерде тек екінші ұрпақта ажырау барысында айқындалады. 7.Гаплоидтарды протопласт пен жасуша өсінділеріне ауыстыру арқылы және кейіннен мутагенез, гендік инженерия және in vitro селекциясы көмегімен өсімдіктердің бағалы белгілерін арттыру мақсатында пайдаланады. Осының барлығы жаңа сортты -3 есе жылдам шығаруға мүмкіндік береді. 8. Гаплоидтерді диплоидтік түрлермен будандастыру арқылы: біріншіден, моногаплоидтер алынады, оларды кейбір хромосомалардың жойылуына байланысты моносомдық генетикалық талдауда қолданады. Екіншіден, гетерозистің триплоидтік түрлері алынады. 9.Гаплоидтерді аласа және басқа пішіндегі сәндік өсімдіктер алу үшін пайдаланады. 10.Гаплоидтерді алшақ будандастыру үшін қолданады. Мысалы, n-48 тетраплоид болып табылатын мәдени картоп жабайы диплоид түрлерімен нашар будандастырылады. Буданның диплоид түрін алғаннан кейін оны қайтадан тетраплоидтік түріне ауыстырады.

Гаплоидтерді алу тәcілдері. Табиғатта гаплоидтер апогамия, гиногенез немесе андрогенез нәтижесінде мейоздың редукциялық бөліну барысында аталық немесе аналық жыныс жасушаларынан пайда болады. Редукцияланған апогамия - ұрықтың синергидтер немесе антиподтардан пайда болуы

Гиногенез /аналық партеногенез/ - спермий тозаңдану кезінде жұмыртқа жасушасына енген соң әрі қарай дамымайды, нәтижесінде ұрықтануға дайын, бірақ ұрықтанбаған жұмыртқа жасушасы гаплоидтік ұрықты түзеді.

Андрогенез /аталық партеногенез/ - спермий жұмыртқа жасушасына еніп, оның ядросын жарамсыз етеді. Спермий ядросы жұмыртқа цитоплазмасымен бірге бөліне бастайды, оның нәтижесінде аталық хромосомалар жиынтығы бар гаплоидтік ұрық пайда болады. Өсімдіктерді химиялық заттармен, иондаушы сәулемен және температураны күрт өзгертіп өңдеу, сәулелендірілген тозаңмен тозаңдандыру, алшақ будандастыруды қолдану – осының бәрі гаплоид алу үшін жасалғанымен, оның пайда болу дәрежесі өте төмен. Сондықтан бұл тәсілдер гаплоидті тұрақты түрде алуға мүмкіндік бермейді.

Қазіргі кезде гаплоидтерді алу үшін мынандай тәсілдерді қолданады:

3. Псевдогамия - жұмыртқа жасушасын бөтен тозаңмен тозаңдандырған соң ол ұрықтанбайды, оның нәтижесінде гаплоидтік ұрық пайда болады.

4. Гаплопродюсер тәсілі - будан ұрығында атаөаналар хромосомаларының бір жиынтығы іріктеліп жойылады.

3) Андрогенез және гиногенез in vitro тәсілдері - микроспоралар мен тозаңқапты (андрогенез), тұқымбүршік пен ұрық қалтасын (гиногенез) қоректік ортада өсіру арқылы гаплоидті өсімдігін алу.

Псевдогамия барысында гаплоидтердің пайда болуы.Түраралық будандастырудың кейбір тіркесімдері құйылысу барысында ұрық пен тұқым ұрықтанбаған аналық гаметадан түзілуі мүмкін. Сонымен қатар псевдогамия сәулемен өңделген тозаңды қолданғанда немесе әр түрлі плоидтық деңгейдегі түрлерді будандастырғанда жүзеге асады.

Гиногенезге ұшырататын будандастырудың нәтижесінде түзілетін ұрықтанбаған қызылша тұқымбүршіктерін зерттеген кезде, гиногенетикалық ұрықтарäûң жұмыртқа жасушасынан немесе антиподтан дамитындығы анықталды. Синергидтер көбінесе жойылады. Өсірілген  тұқымбүршіктен  гаплоидті өсімдік алуға болады. Колхицинмен өңдеу арқылы гомозиготалық дигаплоидті өсімдік алынып, танаптық жағдайында зерттелді.

Гаплопродюсер тәсілі Бульбозум тәсілі. Кейбір алшақ түрлерді будандастырған кезде ұрықтың алғашқы даму кезінде ата-анасының біреуінің хромосомалар жиынтығы жойылатындығы анықталды. Бұл тәсіл селекция жұмысында арпаның жабайы Hordeum bulbosum түрімен будандастыруда кеңінен пайдаланылады. Hordeum vulgare жұмыртқа жасушасын Hordeum bulbosum тозаңымен ұрықтандырғанда генетикалық сәйкессіздікке байланысты аталық хромосомасы жоғалады да, гаплоидті ұрық дами бастайды. Оны зиготаның алғашқы бөліну кезінде байқауға болады. Бұл Hordeum bulbosum геномында хромосоманың митотикалық ұршық жіпшелеріне жалғасу механизмнің болмауы деген болжау бар. Аналық өсімдікте ұрықтың қалыпты өсуі тежеледі, сондықтан оны оқшаулап, қоректік ортада өсіріп жетілдіреді. Одан кейін гаплоидті өскіндерді хромосома санын екі еселеу және гомозиготалық изогендік линиялар алу үшін колхицинмен өңдейді.

Осы тәсілмен Канадада арпаның Минго және Родео сорттары шығарылды.

Бүкілодақтық селекция, генетика институтында гаплоидтік селекция негізінде, қысқа мерзім ішінде (8- жыл орнына 4-5 жыл ішінде) арпаның Исток, Одесский-15 сорттары шығарылды. Олар жоғары өнімді, жатып қалуға және қаракүйеге төзімді. Элита Поволжья деп аталатын ғылыми кәсіподақ осы тәсілдерді қолдана отырып, қуаңшылыққа төзімді 7-ден астам арпа линияларын алды. Оңтүстік-Шығыс ауылшаруашылық ғылыми–зерттеу институтында көптеген жаздық бидай мен арпа линиялары алынды. Бүкілодақты қауылшаруашылық биотехнологиясының ғылыми-зерттеу институтында (НИИСХБ) болашағы бар бидайдың андрогендік линиялары алынды.

In vitro жағдайында қоздырылған андрогенез. Жекелеген тозаңқаптарды өсірген кезде олардың тозаңдарының қалыпты гаметофит арқылы даму жолы тежеліп, спорофиттік жолға көшкен кезде гаплоидтік өсімдік пайда болады. Қазіргі кезде осы тәсіл бойынша -ден астам өсімдік түрі алынды. Әсіресе, бұл тәсілмен Қытай селекционерлері нәтижелі жұмыс істеді. Олар жаңа жоғары өнімді әрі төзімді күріш пен бидай сорттарын шығарды. Бүгінгі таңда сол күріш 7 га, бидай 7 га алқапта өсіріледі. Тозаңқапты өсіру. Қазіргі кезде тозаңқаптан гаплоидті өсімдікті алу әдісі кеңінен қолданылып келеді. Тозаңқап өсіндісінде микроспорадан эмбриоид құрылымы немесе каллус ұлпасы түзіледі. Эмбриоид құрылымын арнайы жағдайда өсірген кезде хромосомаларының жиынтығы гаплоидты өскін алуға болады. Мұны тікелей андрогенез дейді. Көп жағдайда регенеранттар каллусогенез арқылы пайда болады /мысалы, күріште/, мұны жанама андрогенез дейді. Егер микроспорадан каллус ұлпасы қалыптасса (15-сурет), гаплоидті өсімдік алу күрделене түседі, себебі алдымен сабақ органогенезін қоздыру керек, кейін одан өркен түзілуі жылдамдатылады, бұл әрқашан бола бермейтін жағдай.

Сонымен қатар, каллус ұлпасы генетикалық тұрақтылыққа ие болмайды, одан алынған регенеранттар алғашқы өсімдіктегі бағалы қасиетті сақтай алмайды, кейде одан пайда болған өсімдіктер гаплоидті болмауы мүмкін. Сондықтан тіршілікке икемді эмбриоидтерді микроспорадан алу өте сирек болғанымен, генетикалық және селекциялық жұмыстар үшін гаплоидтерді алу үшін бірінші тәсіл-тікелей андрогенез оңтайлы болып отыр. Тозаңқапты өсіру арқылы гаплоидтерді алу тәсілінің мәні мынада. Алдын ала залалсыздандырылған бітеугүлден in vitro жағдайда тозаңқаптарды айырады. Оларды қолма-қол қоректік ортаға орналастырады, орта құрамын әрбір өсімдікке арнайы таңдап дайындайды. Тозаңқапты алу сәтінде олардың микроспоралары эмбриогенезге көшу үшін қолайлы даму кезеңінде болғаны өте маңызды.

Көптеген жағдайда тозаңқапты айыру үшін тиімді кезеңі деп микроспораның ортаңғы немесе соңғы даму кезеңін айтады. Бұл кезде микроспоралар тетрададан бөлініп, бірінші митозға дайындалады. Бірақ көптеген өсімдік түрлері үшін тетрада кезеңі мен екі ядролық тозаң түйіршігі кезеңі аралығында тиімді болу мүмкін. Мысалы, қырыққабаттар үшін тиімді кезең микроспораның бір ядролық алғашқы даму кезеңі болса, бидай микроспоралары үшін бір ядролық ортаңғы даму кезеңі болып саналады. Микроспоралар қалыпты дамуынан ауытқу нәтижесінде тікелей андрогенезге өтуі мүмкін, бұл жағдайда гаплоидті ұрық, каллус түзбейөақ, тікелей микроспорадан /вегетативтік немесе генеративтік жасушадан/ пайда болады немесе ол каллус түзе бастайды. Бірінші тікелей андрогенез жағдайында микроспора бөлінеді де, ңқөғқ жасушалық проэмбрио түзеді, ұрық глобула тәріздес кезеңінде экзинаны жарып, әрі қарай дамиды. Каллус ұлпасы түзілген /тікелей жол емес/ жағдайда тозаң бөлінеді, бірақ бөліну кезінде пайда болған жасушалар тез ұлғаяды және тозаң түйіршігінің қабығын жарып, каллус массасын құрайды. Микроспоралардан гаплоид регенераттары түрлі жолдармен пайда болады. Тозаңқаптан алынған өсімдіктің ерекшелігі негізінен оның тікелей андрогенез немесе каллус ұлпасы арқылы пайда болғандығына байланысты. Тікелей андрогенез жолымен алынса, нағыз гаплоидті өсімдік шығады -1n, ал каллустан өсірілгенде, ди, три, тетраплоидтер, яғни 2n,3n,4n, және т.б. эуплоидтер, анеуплоидтер, сонымен қатар, басқа генетикалық өзгерістері бар өскіндер алынады. Жасушалардың полиплоидтылығы ядролардың қосылуы, хромосомалардың эндоредупликациясы, сандарының өзгеруі және микроспораның түзілуіне байланысты болуы мүмкін. Бұл жағдайда гаметоклоналдық варианттар деп аталатын өсімдіктер қалыптасады. Гаметоклоналдық өзгергіштік-микроспора, тозаңқап, ұрық қалтасын, яғни гаметаларды қоректік ортада өсіргенде жүзеге асатын өзгергіштік.

Жасуша селекциясындағы сияқты, микроспора өсіндісін қоректік ортаға тұз, гербицид, уыт қосып, тағы басқа қолайсыз жағдайда өсіру арқылы төзімділікті арттыруға болады. Гаметоклоналдық өзгергіштіктің нәтижесінде гаплоидті өсімдік пайда болуының маңызы зор. Гаплоидті өсімдіктер арасынан мутанттық генотипті анықтап, сұрыптау өте жеңіл. Бидайдың тозаңқап өсіндісінде NaCl тұзына төзімді гаметоклоналдық регенеранттар алу мүмкіншілігі зерттеліп тұзға төзімді Ю-580R линиясы алынды. Абсциз қышқылы енгізілген қоректік ортасын қолданып, кұрғақшылыққа төзімді АR-45 линиясы сұрыпталды, тағы басқа in vitro әдісінің көмегімен алынған регенерант линиялары Шортандыдағы ғылыми-өндірістік орталықта конкурстық сорт сынаудан өтуде 20-21-22-23-24-25-суреттер (Бекқожина, 2000, 2005), регенерант-линияларының RAPD талдау әдісімен ДНК полиморфизмі зерттелуде ( 26-сурет).

Гаметоклональдық өзгергіштіктің қауіпті салдары ретінде альбинос өсімдіктерінің пайда болуын айтуға болады, мысалы бидай, жүгері тозаңқаптарынан алынған өсімдіктен түссіз өсімдіктер шығуы мүмкін. Альбиностар мен олардың жасыл өсімдіктері санының ара салмағы өсімдік түріне, тозаңқаптың даму кезеңіне және өсіру жағдайына байланысты.

4.3 Тозаңқап өсіндісінде эмбриоид құрылымының пайда болуына әсер ететін себептер

Микроспора мен тозаңқаптан алынатын гаплоидтердің шығуы көптеген факторларға байланысты екендігін көптеген зерттеулер анықтады. Осындай факторға ең алдымен өсімдік түрі мен сортының ерекшеліктері жатады, яғни маңызды себептердің бірі – өсімдіктің генетикалық құрылысы. Бидай, темекі түрлерінің, картоп сорттарының, бір-бірінен айтарлықтай айырмашылықтары болады. Көптеген өсімдіктердің микроспораларынан тіршілікке қабілетті гаплоидті өскін қандай жағдайда түзілетіндігі әлі де белгісіз. Донор өсімдікті мынандай жағдайда өсіреді:

• 8 сағаттық қысқа күн

• өте жоғары жарық қарқындылығы 20 000- 30 000 лк

• төменгі түнгі температура 12-18⁰С, күндізгі -25⁰С;

^{Гаплоидтердің шығымына өсімдіктің жасы, гүл бүршігінің өсімдікте орналасу жері, гүлдену басталған соң өткен уақыт әсерін тигізеді. Қазіргі таңда бітеугүлдерді гүлденудің бас кезіндегі өсімдіктерден алу ұсынылады. Қоректік ортаның құрамы да өз әсерін тигізеді. Мысалы, картоп тозаңқаптарын өсіру барысында микроспоралар эмбриогенезге көшу үшін сахарозаның 6% оң нәтиже береді, ал бидайға 10 % қажет. Басқа өсімдіктердің тозаңқабына 2-3 % сахароза қажет, сонымен қатар, сахарозаны глюкоза немесе басқа қантпен алмастыруға болады.}

^{Жақсы нәтиже алу үшін көптеген жұмыстарда оқшауланған тозаңқаптарды алдын ала +4-+6С төмен температурамен өңдейді. Өсімдіктің түріне байланысты өңдеу уақыты 2-14 тәулік аралығында өзгеріп отырады (27- сурет).}

^{Төмен оң температура әсерінен тозаңның қалыпты бөлінуі тежеліп, оның эмбриогендік қабілеті ұлғаюы мүмкін. Оқшауланған тозаңқаптарды немесе бітеугүлдерді центрифугамен алдынөала өңдесе, ол эмбриогенезге дәл осылай сияқты әсер етеді. Осындай стресс жағдайы тозаңқаптағы спорогенездің қалыпты жолына бөгет жасайды, бұл өз кезегінде оның микроспорасының эмбриогенез немесе каллусогенез жолына ауысуына себеп болады.}

^{Тозаңқаптарды алдын-ала суықпен өңдеп, қоректік ортада біраз уақыт өсірсе, одан кейін оларды оқшаулап жаңа қоректік ортаға орналастырса, тозаңнан эмбриоидтердің шығымы арта түседі.}

^{Тозаңқап өсірудің кемшіліктері де бар. Біріншіден, өсімдіктер тозаңнан ғана өніп шықпайды, олар тозаңқап қабырғасының әр түрлі жасушаларынан да түзіледі, сондықтан олардың хромосома жиынтығы бірқалыпты болуы екіталай, яғни плоидтық өзгерістер болуы мүмкін.}

^{Екіншіден, тозаңқап қабырғасы эмбриогенез құбылысын тежейтін кейбір заттарды түзуі мүмкін. Үшіншіден, жоғарыда қарастырылған альбиностар пайда болуы мүмкін. Төртінші кемшілік – тозаңқаптан эмбриоидтердің шығымы кейбір өсімдіктерде өте төмен.}