26 Билет
1.Каллус ўлпасын өсіру үшін екі тәсілді ќолданады: тығыз ортада және сўйыќ ортада, яғни терең ќабатта өсіру. Бірінші тәсіл алғашќы каллус ўлпасын алу үшін және өсімдікті өз ќалпына келтіру үшін ќолданады. Екінші тәсілді – сўйыќ ортада өсіру, көбінесе өнеркјсіп технологиясында, биохимиялыќ және физиологиялыќ зерттеулерде, пайдалы екінші зат алмасу метаболиттерін алуда және жасуша селекциясында ќолданылады. Бўл тәсіл бойынша жеке жасушаларды немесе олардың шағын бөлшектерін сўйыќ ортада үнемі араластырып, ауамен толыќтырылып отыратын жағдайда өсіреді.Каллус ўлпасынан суспензия өсіндісін алу. 2-3 г борпылдаќ каллусты 60-100 мл араласып тўратын сўйыќ ортаға көшіргенде, суспензия өсіндісі алынады. Одан кейін колбаны жылдамдығы минутына 100-150 айналымы бар айналғышќа орналастырады. Каллус ўлпасын жеке жасушаларға бөлшектеу және жаќсы өсетін суспензия пайда болу їшін алғашќы ўлпасын 2,4–D ќосылған Са+ иондарсыз ортада өсіреді, сондай-аќ тасымалдау алдында пектиназа ферментімен өңдеу ќажет. Содан кейін алынған алғашќы сўйыќ ортаны 1-2 ќабат сүзгі арќылы өткізіп, каллус ўлпасының ірі бөлшектерінен бөліп алады.
Суспензия өсіндісін тікелей өсімдіктің мүшелерінен (түйнектерден, картоп түйнегінен, сәбіздің ќор їлпершегінен) де алуға болады. Біраќ бўндай жол ќиындау және көп уаќытты талап етеді. Эксплант жасушалары алғашќы каллус түзуге тиісті, содан кейін єана сўйыќ ортаға түсіп, көбейген каллус жасушалары сўйыќ ортада өсе алатын жаңа линияны бастайды.
Жасушаның әрбір линиясы үшін инокулюмның (келесі ортаға көшірілетін суспензия өсіндісінің бөлімі) ең аз мөлшері алынады. Инокулюмның мөлшері азайған сайын, лаг–фазаныѕ ўзаќтығы ўлгая түседі. Сўйыќ ортада өсетін жасушаны жүйелі түрде жаңа ќоректік ортаға жиі көшіріп отыру ќажет, өйткені еріген ќоректік заттарға бай сўйыќ ортада жасуша барлыќ жағынан толыќ ќамтамасыз етіліп, жасушалары тез бөлініп, өсуі де жылдамыраќ болады. Жаќсы сўйыќ ортада өсетін жасуша линияларының саны 5-10 жасушадан көп болмауы керек. Морфологиялыќ жағынан жасушалар /мөлшерлері кішірек, цитоплазмасы тығыз, пішіні жўмыртќа тәрізді/ біркелкі болады.
2 Сүт қышқылды бактерия ең алғаш 1887 жылы бөлініп алынған. Кейінірек лактозаны (сүт қанты) ашытатын басқа да микроорганизмдер анықталған. Сүт қышқылды ашудан алынатын соңғы өнімдеріне қарай микробтарды екі топқа бөледі: гомоферментативті және гетероферментативті. Оның біріншісі тек сүт қышқылын түзсе, ал екіншісі – сүт қышқылынан басқа ұшпа қышқылдарды, хош иісті заттарды, этил спиртін, көмір қышқыл газын, сутегін және т.б. түзеді.
Гомоферментативті сүт қышқылды бактериялар гексозаны ыдыратып, сүт қышқылының екі молекуласын түзеді. Соңғысы аралық өнімдерден, яғни ПЖҚ мен сутегінің қосылуынан пайда болады. Ортада қышқылдың концентрациясы жоғары (рН 4,6) болғанда казеиннің ұюы байқалады.
Гомоферментативті сүт қышқылды ашудың қоздырғышы Streptococcus lactis антимикробтық қасиетті иеленген (грам-оң бактериялардың өсіп-өнуін тежейді) полипептидті антибиотиктерді – низиндерді түзейді. Сонымен қатар, сүт қышқылды ашудың қоздырғыштарына Streptococcus cremoris (қаймақтан алынған таяқша), Lactobacterium bulgaricum (болгар таяқшасы), Lactobacterium acidophilum (ацидофилді таяқша), Lactobacterium casei (ірімшіктен алынған таяқша), кефир мен қымыздан алынған таяқшалар, т.б. жатады. Ашудың бұл түрі қатық, қымыз, кефир дайындауда, сүт қышқылын алуда және көкөністер мен азықтарды консервілеуде кеңінен қолданылуда.
Гетероферментативті (аромат түзуші) микроорганизмдерге Str.citrovorus, Str.paracitrovorus, Str.diacetilactis, Str.thermophilus жатады. Олар сүт қышқылды тағамдарға жақсы дәм мен хош иіс береді. Сүт қышқылды тағамдарды дайындау үшін аромат түзуші стрептококктарды гомоферментативті микроорганизмдермен араластырады.
Сүт қышқылы бактерияларды сүт тағамдарын дайындауда қолдану. Гомоферментативті сүт қышқылы бактериялары сүт шаруашылығында кеңінен қолданылады. Олар сүттен қышқыл сүт тағамдарын даярлауда пайдаланылады. Сүт қышқылы бактериялары әсерінен ортада сүт қышқылы пайда болады.
Қышқыл ортада шіріту бактериялары да тіршілік ете алмайды. Сүтте казеин, түрлі минерал тұздар, негізінен сүт қанты бар. Міне сондықтан да ол сүт қышқылы бактерияларына ең қолайлы орта болып саналады.
Сүттегі микроорганизмдердің саны мен сапасы оны сақтау жағдайына байланысты. Бұл көптеген микроорганизмдердің сүтке сырттан келіп түсетінін аңғартады. Желіндегі сүттің бір миллилитрінде не бары 300-400-дей бактериялар болады. Ал сауылған сүтте микроорганизмдердің мөлшері бұдан да көп, оның негізгі себебі – сауу кезінде тазалықтың сақталмауы. Егер санитарлық және гигиеналық ережелер қатаң сақталып, соған сәйкес сүтті сақтау жағдайы өзгерсе, көп кешікпей-ақ бактериялар көбейіп кетеді.
Сүтті сауғаннан бастап екі тәулік ішінде +30°-та ұстаса, бактериялар ете жақсы дамиды да, тез көбейеді. Ал температура жоғарылайтын болса, олардың біразы қырылып қалады. Әдетте жаңадан сауылған сүтте бактериялар бірден қаулап көбеймейді. Бұл сүтте бактериялардың өсуін тежейтін зат болатынын аңғартады. Сауылғаннан кейін сүт неғұрлым тез салқындатылса, солғұрлым онда бактериялар да азаяды. Салқындату қазір практикада кеңінен қолданылады.
Сауылған сүтте көбінесе сүт қышқылы бактериясының да болатыны анықталған. Май қышқылы бактериялары сүт қантынан май қышқылын түзеді. Оның иісі аса өткір және ұнамсыз болады. Май қышқылы бактерияларының споралары жоғары және төменгі температураға төзімді келеді. Сондықтан Бұларды сүтке түсірмеу – сапалы сүт тағамдарын даярлаудың басты шарты.
Сүтте болатын микроорганизмдердің 90%-тейі шіріту бактерияларынан тұрады. Бұлар сүт қантын ашытпағанмен, ондағы белокты ыдыратады. Сөйтіп, сүтте аммиак және басқа ұнамсыз иісті заттар түзіледі. Алайда шіріту бактериялары қышқыл ортаға төзімсіз болғандықтан қышқыл сүт тағамдарында шіріту бактериялары кездеспейді.
Сүтте ашытқы саңырауқұлақтар да болады. Сүт қантынан олар азғана мөлшерде (4,5%) спирт түзеді. Қымыз және кефир даярлағанда спирт едәуір мөлшерде жиналады. Өйткені Бұл тағамдарда ашытқы саңырауқұлақтар мен сүт қышқылы бактерияларының бірлесіп тіршілік етуіне қолайлы жағдай туады.
Ауалы жерде қышқыл сүт тағамдарында микроскоптық саңырауқұлақтар да тіршілік етеді. Олар бар жерде сүт қышқылы мөлшері азайып, шіріту бактерияларының тіршілігіне қолайлы жағдай туады.
Жалпы сүттегі микроорганизмдердің сапасы да, саны да өзгеріп отырады және бұл өзгеріс белгілі бір кезеңдермен жүреді.
Алғашқы кезеңде сүтке түскен бактериялар топтарының барлығы дерлік тіршілік етеді. Оның басым көпшілігі – шіріту бактериялары болады. Екінші кезеңде ортада сүт қышқылы бактерияларының әсерінен сүт қышқылы жиналады да, шіріту бактерияларының, тіршілігі тежеледі. Ал үшінші кезеңде сүт қышқылы бактерияларының тіршілігі баяулайды. Төртінші кезеңде жиналған сүт қышқылының әсерінен сүт қышқылы бактерияларының өздері қырыла бастайды. Әдетте шар тәрізді бактериялар ашудың бастапқы кезеңінде тіршілік ететіні анықталған. Кейін олардың қышқылға төзімді таяқша тәрізділері тіршілік етеді. Сүт қышқылы бактерияларымен бір мезгілде ашытқы саңырауқұлақтар да тіршілік етеді.
Қазіргі кезде сүттен толып жатқан тағамдар даярлайды. Солардың бірі – сүттен жасалатын айран, екіншісі – кілегейден жасалатын қаймақ.
Айран ұйыту үшін сүт алдымен +85-90°-та пастерленеді. Пастерленген сүтті 10-15 минуттай салқындатады. Сонда сүт температурасы +30°-қа төмендейді. Бұған таза сүт қышқылы бактерияларынан даярланған ұйытқы қосылады да, 6-8 сағат ішінде сүт ұйып, айран болады. Оны салқын жерде сақтайды. Сүт қышқылы микробтарының ішінен ұйытқыға болгар таяқшасын қолданады.
Қаймақ және сүзбе жасауда да осы микроорганизмдер қатысады. Бұл тағамдар көп уақытқа шыдамай бұзылып кететін болғандықтан, белгілі бір уақыт ішінде оларды тұтынуға жіберіп отыру керек.
Пастерленген сүттен ацидофиль айранын да жасайды. Ол болгар таяқшасының қатысуымен жасалған айранға өте ұқсас болады. Ацидофиль таяқшалары +37-40°-та сүтті бір қалыпты, тұтқырландыра ұйытады. Алынған енім ацидофилин деп аталады, Ацидофиль таяқшалары бар жерде шіріту бактерияларының тіршілігі тежеледі. Ацидофиль таяқшаларының осындай қасиеті анықталғаннан кейін, оның қатысуымен даярланған айранды асқазаны ауру адамдарға және балаларға шипа ретінде қолдану ұсынылды.
Сонымен қатар ацидофиль айранын мал шаруашылығында жас төлдерді азықтандыруға да қолданады. Бұл төлдерді асқазан ауруларынан сақтандырады. Қышқыл сүт тағамдарына кефир жатады. Оны даярлау үшін қайнатылған сүтке кефир ашытқы саңырауқұлақтарын және сүт қышқылы бактерияларын қосып ұйытады. Кефир даярлауда екі процесс, яғни сүт қышқылы және спирттік ашу процестері қатар жүреді. Мұнда температураның зор маңызы бар. Өйткені 20°-та сүт қышқылы ашу процесі жүреді, ал температура +15°-тан төмендегенде спирттік ашу процесіне қолайлы жағдай туады. Кефир – өте дәмді, аздап қышқылдау, қоймалжың сусын. Онда 1%-тей спирт, 1%-тей сүт қышқылы болады.
Кефирдің дәмін, сапасын жақсарту мақсатында қазір заводтарда оны даярлау технологиясын да аздап өзгертті. Ол үшін алдымен кефирге тән микроорганизмдердің тіршілік етуіне қолайлы жағдай жасалады. Температура +20-22°-қа төмендетіледі. Өйткені жоғары температурада ашытылатын болса, сүт қышқылы бактериялары тез арада ашытқы саңырауқұлақтарының тіршілігін баяулатады. Кефир даярлау барысында ондағы белок заттары аздап ыдырап, амин қышқылдарына айналады. Бұл тағамның сіңімділігін арттырады. Үю және даяр болу уақытына байланысты кефирді бір күндік, екі күндік және үш күндік, яғни күшті кефир деп бөледі.
Технологиялық ережелер сақталмағанда кефир бұзылып кетеді де, ондай бұзылған кефирді тұтынуға болмайды.
Қышқылды сүт тағамдарынан жиі пайдаланатындарының бірі – қымыз. Оны даярлауда да сүт қышқылы бактериялары, ашытқы саңырауқұлақтар қатысады, температурада Бұл микроорганизмдер жақсы дамиды. Қымызда Бұлар 2%-тей спирт, 1%-тей сүт қышқылының түзілуіне себепші болады. Қымызға тән микроорганизмдердің біріне термофильді сүт қышқылы бактериялары жатады.
Қымыз – организмге оңай сіңетін сусын. Ондағы сүт қышқылы асқазан бездеріне әсер етіп, ас қорытуды жақсартса, аздаған мөлшердегі спирт пен көмір қышқыл газы организмдегі зат алмасу процесін күшейтеді.
Қымыздың қазір емдік қасиетінің барлығы анықталды. Сүт қантын ашытатын саңырауқұлақтар адамдағы өкпе ауруын қоздырушы туберкулез бактерияларының тіршілігін тежейді. Соңғы жылдары қымыз сиыр сүтінен де даярланып жүр. Бұл үшін сүт қышқылы бактериялары мен ашықты саңырауқұлақтардың таза түрлері қолданылады. Сүт қышқылы бактерияларының ішінен ацидофиль және болгар таяқшалары қатысады, ал спирттік ашу процесіне арнап шампан немесе нан ашытқы саңырауқұлақтарын алады. Сиыр сүтінен де қымыз даярлауға болады. Оның технологиясы мынадай: майы алынған сүтке 20%-тей су құйып, сұйылтады да, 5) шамасында қызылша қантын қосады. Бұл қоспаны 15 минуттай +90°-та пастерлейді. Мұндағы мақсат – сүтте кездесетін басқа микроорганизмдерді қыру. Температура +40-45°-қа жеткенде оған 3-5% шамасында таза микробтардан алдын ала даярланған ашытқы қосады. Ашу процесі +35-37°-та жүреді. Бұдан кейін ұйыған сүтті жақсылап араластырады да, 30°-та ашытқы саңырауқұлақтарды қосып, тағы да ұқыпты түрде араластырады. Ашу процесі аяқталғаннан кейін қымызды бөтелкелерге немесе сол сияқты арнаулы ыдысқа қүйып, + 10-12°-қа дейінгі температурада арнаулы бөлмелерде одан әрі ашытады. Күшті қымыздар осындай температурада шамамен 12-16 сағат ішінде даяр болады.
Сиыр сүтінен даярланған қымыздың бір кемшілігі – жазда одан газ көбірек бөлінуінде. Сондықтан жаз айларында мұндай қымызды даярлағанда қантты аз (3%) қосу керек. Мұның өзі шамадан тыс болатын спирттік ашу процесін тежейді. Қымыз шипалық мақсатта қолданылатын болғандықтан, сүтті сумен сұйылтудың орнына іркіт (кілегейден май алғанда қалатын қалдық, майдың суы) сияқты дәмді сусындарды қосқан жөн.
Сүт қышқылы бактерияларының наңды ашытып пісіруде де зор маңызы бар. Әсіресе қышқыл дәмді қара нанды даярлағанда олар актив қатысады. Нан пісіруде сүт қышқылы бактериялары тіршілігіне қолайлы жағдай жасайды. Нанның көтеріліп пісуі де осы сүт қышқылы бактерияларың тіршілігіне байланысты.
Ашытқы саңырауқұлақтар мен сүт қышқылы бактерияларының бірлесіп тіршілік етуі эволюциялық даму барысында қалыптасқан.
Қышқыл сүт тағамдарының ішінен Орта Азия тұрғындарына, әсіресе қазақ халқына ежелден мәлім сусын – шұбатты атап өткен жөн. Шұбат түйе сүтінен даярланатын, шипалық қасиеті бар өте дәмді сусын. Мұнда да сүт қышқылы ашу және спирттік ашу процестері жүреді. Шұбатты даярлау үшін жаңа сауылған түйе сүтіне 10-40%-тей алдын ала даярланған ашытқы қосылады. Сүтті ағаш күбіде немесе қыш құмыраларда ашытады. +25-30° температурада сегіз сағат ішінде өзіндік иісі және дәмі бар шұбат ішуге даяр болады. Түйені әрбір сауған сайын сүтті шұбатқа қосып отырады. Шұбатта көбік көп болады. Ұзақ уақыт тұрып қалған шұбат шамадан тыс ашып, дәмі өзгеріп кетеді де, ішуге жарамай қалады.
Шұбат микроорганизмдерін зерттегенде одан жоғары температурада тіршілік ететін термофильді сүт қышқылы бактериялары табылған. Олардың пішіні таяқшаларға ұқсайды. Сүт қышқылы стрептококк бактериялары өте аз мөлшерде болады. Ашытқы саңырауқұлақтардан, әсіресе , сүт қантын ашытатын түрлері кездеседі. Сөйтіп шұбат даярлауда негізінен термофильді сүт қышқылы таяқшалары және аздаған мөлшерде стрептококтар және ашытқы саңырауқұлақтар қатысатыны анықталды. Сонымен қатар түйе сүтін пастерлегеннен кейін де ашытып, сапалы шұбат алуға болатыны дәлелденді.
Сүт қышқылы бактерияларды көкөністерді сақтауда пайдалану. Көкөністерді ашыту – оларды сақтаудың тиімді жолының бірі. Сондықтан оларды ашыту арқылы сақтау, жыл мерзімінің салқын кездерінде халықты түрлі витаминді азықтармен қамтамасыз етуге мүмкіндік береді. Қиярды, капустаны ашытып сақтауда да микроорганизмдер қарқынды қатысады. Олардың ішіндегі негізгілері – сүт қышқылы бактериялары. Олардың әсерінен азықта сүт қышқылы түзіледі. Оның мөлшері шамамен 0,9-1,2%-тей болады. Сүт қышқылы бактерияларының ішінде Бұл процеске бактериум кукумерис ферментати қатысады. Оның тіршілік етуіне қолайлы температура +34°. Қиярды ашыту негізінен үш кезеңнен тұрады. Бастапқы кезеңде қиярдағы қант ерітіндіге көшеді де, онда сүт қышқылының әсерінен басқа микроорганизмдердің тіршілігі тоқталады. Ортада тек сүт қышқылы бактериялары қалады. Үшінші кезеңде ортада жиналған сүт қышқылының әсерінен сүт қышқылы бактерияларың өздері де қырылады, сөйтіп, қияр консервіленеді.
Қиярды ашытуда да таза сүт қышқылы бактерияларынан даярланған ашытқыны қолдану жақсы нәтиже береді. Мұнда сүт қышқылы ашу процесі тезірек жүреді де, қышқыл молырақ жиналып, азық тез консервіленеді. Осы тәсілмен даярланған қиярдың дәмі жақсы, жеуге біршама сүйкімді келеді.
Капустаны ашытуда да дәл осыған ұқсас процесс жүреді. Онда да 1%-тей сүт қышқылы жиналады. Жалпы қиярды және капустаны ашытқанда олардың әрбір тоннасына 25-30 кг ас тұзы қосылады. Ac тұзы азықтан шырынның бөлінуін тездетіп қана қоймай, сүт қышқылы бактерияларының тіршілігіне де қолайлы жағдай туғызады.
Сүт қышқылын өндірістік тәсілмен өндіру. Түрлі қажеттерді өтеу мақсатында қазіргі кезде сүт қышқылын өндірістік тәсілмен алу да жолға қойылды. Мұндағы негізгі мақсат – алынатын шикізаттан барынша сүт қышқылын өндіру. Қазір осындай мақсатта Тhermobacterium ceraleae сүт қышқылы бактериясы қолданылады. Бұл гомоферментативті организм, ашытуға алынған қанттың 98%-ін сүт қышқылына айналдырады. Оған ең қолайлы температура +48-50°. Бұл температураның ең тиімді жағы сол, басқа микроорганизмдер осындай жағдайда тіршілік ете алмайды. Тhermobacterium ceraleae қанттардан декстрозаны, левулезаны, галактозаны, мальтозаны, сахарозаны жақсы ашытады. Ал сүт қанты лактозаны ашыта алмайды. Ол әсіресе солод сығындысында жақсы тіршілік етеді. Әдетте сүт қышқылын алу үшін дайын қантты емес крахмалды пайдаланады. Ол үшін крахмал алдын ала солод ферментінің көмегімен жай қантқа айналдырылуы қажет. Алынған сүзіндіні 50°-қа дейін жылытады да, оған 2%-тей таза, даяр Lhermobacterium ceraleae қосады. Мұнда пайда болған сүт қышқылы ортадағы бормен байланысады да, орта қышқылдығы кеп артпай, сүт қышқылы бактерияларының тіршілігіне қолайлы болып қала береді. Бірақ борды қосудың алдында оны жеке зарарсыздандыру керек. Технологиялық ережелерге сай болғанда ашу процесі 5-6 күнде аяқталады. Ашу аяқталғаннан кейін алынған қоспа +100°-қа дейін қыздырылып, бактериялар өлтіріледі, сөйтіп, белоктар тұнбаға шөгіп, сұйықтық мөлдірленеді, оны арнаулы сүзгіден өткізіп, тез салқындатады. Салқын сұйықтық күкірт қышқылмен өңделеді. Соның нәтижесінде сүт қышқылы және күкірт қышқыл кальций жеке бөлінеді. Сүт қышқылының сұйықтықтағы мөлшері 10%-тей. Бұдан әрі оны осы күйінде немесе арнаулы әдіспен тазартып, тұтынуға жіберіледі.
3Бактериялардың өсуі мен көбеюі. Өсу деп жасуша массасының ұлғаюын айтады, ал микробтың көбеюі дегеніміз популяцияда жасушалардың санының артуы. Прокариоттардың дені көлденең бөліну арқылы, ал кейбіреулері бүршіктенудің көмегімен көбейеді. Саңырауқұлақтар спора түзу арқылы, ал актиномицеттер жіпше тәріздес жасушаларының бөлшектенуі нәтижесінде көбейеді. Хламидиялар көбею кезінде келесі сатылардан өтеді: элементарлық денешіктер – ретикулярлық денешіктер – аралық пішіндер – элементарлық денешіктердің жаңа буындары. Микоплазмалар бөлшектену немесе бүршіктену арқылы көбейеді.
Тығыз қоректік орталарда микробтар колония деп аталатын жасушалардың шоғырын түзейді. Микроорганизмдердің колониялары өздерінің мөлшері, пішіні, беткейі, түсі, мөлдірлігі және т.б. белгілері бойынша әртүрлі болып келеді. Сұйық қоректік орталарда бактериялардың өсуі ортаның бетінде қабықтың түзілуімен немесе біркелкі лайлануымен, ал кейде тұнба шөгуімен сипатталады. Микробтардың көбеюі кезінде: 1. бастапқы; 2. логарифмдік; 3.стационарлық (тұрақтылық) және 4. өлу сатыларын ажыратуға болады.
Микроорганизмдер (облигатты немесе қатаң жасушаішілік паразиттерден басқалары) өздерінің талғамына қарай керекті заттары бар жасанды қоректік орталарда өсіріледі. Өздерінің құрамына байланысты қоректік орталар қарапайым (етті пептонды агар және етті пептонды сорпа) және күрделі (құрамында қан сары суы, әртүрлі көмірсулар және т.б. заттары бар) болып келеді. Белгілі бір микроорганизмдердің түрін өсіру үшін элективті немесе таңдамалы қоректік орталар қолданылады. Вирустар, риккетсиялар және хламидиялар жасанды қоректік орталарда өспейді, олар тек ұлпалардың өсіндісінде ғана көбейе алады.
Өсіру деп құрамы және қасиеттері әр түрлі қоректік орталарда немесе қандай да бір бейім организм жағдайында микроорганизмдерді жасанды жолмен көбейтуді айтады.
Өсіру үрдісі кезінде микроорганизмдердің көп мөлшерде жиналуы мен бөлінуі қалыптасады. Бұл мақсатта жануарлар немесе жасанды жолмен алынған сұйық, жартылай сұйық және тығыз қоректік орталар қолданылады.
Микробиологиялық өндірудің негізі ол тіршілікке қажетті микроорганизмдердің өнімдерін және микроб биомассасының қажетті мөлшерлерін жинап алу үшін өсіру болып табылады. Микроб биомассасының өндірісінде өсірудің негізгі көрсеткіштері ол микроорганизмдердің көбейуі мен өсу интенсивтілігі. Бұл көрсеткіштерді жоғарылату үшін микробиологиялық өндірістердің технологиялық шарттарын қалыптастыру қажет.
Микробиологиялық синтездеудің технологиясы продуцент ретінде қолданылатын микроорганизмдердің қасиеттерінің негізінде құрылады.
Продуценттерді өндіру мүмкіншіліктеріне немесе тәуелділіктеріне байланысты беткейлік және терең әдістермен өсіреді.
Беткейлік тәсілмен өсіру әдісі өте қарапайым, бұл әдіспен микроорганизмдерді тығыз және сұйық қоректік ортаның беткейінде өсіреді.
Продуцент өсіндісін қоректік ортаға сепкеннен кейін, өсіруді нақты бір уақыт аралығында оптималды жағдайда жүргізеді. Сол себепті бұндай жағдайды кезендік тәсіл деп атайды.
Кезендік культура. Себінді материалын алу үшін кезендік тәсілді қолданады. Оның басты маңызы өсіру кезінде қоректік ортаның компоненттері түспейді және метаболикалық өнімдер ыдырамайды. Бұндай жағдайды жабық жүйе деп атайды. Осындай жағдайларда фаза алмасулармен сипатталатын лаг-фаза, экспоненциалды (логарифмдік), стационарлық және өлу фазасы (1-сурет) сияқты нақты бір даму циклдерінен өту арқылы микроорганизмдер өсіп көбейеді.
1-ші фаза қоректік ортаға инокулятты енгізуден басталады да, микроорганизмдердің бастапқы көбеюіне дейін созылады. Бұл фазаның басты маңызы жаңа ортаға бейімделуі. Лаг-фазаның ұзақтылығы микроорганизмдердің физиологиялық ерекшеліктерімен, өндірістік, себінділік қоректік орталардың құрамымен, өсіру шарттарымен, культура жасымен және себінді мөлшерімен анықталынады. Микроорганизм әлдеқайда жас болатын болса, соғұрлым лаг-фаза сатысы қысқа болады. Аталмыш жағдайда жасушада айтарлықтай өзгерістер болмайды тек бірен-саран биохимиялық өзгерістерді байқауға болады: ақуыздардың құрамы, рибосомалардың саны көбейеді, ферментті жүйелердің белсендіруі байқалады. Жасушалардың саны көбейеді.
2-ші фаза экспоненциалды немесе логарифмді деп аталады. Бұл фазада өсу тұрақтандырылады. Зат алмасу өнімдерімен және қоректік заттардың жетіспеушілігі болмайды. Ен бастысы максималдық өсу жылдамдығы қалыптасады. Кез келеген өсіндінің сапалы өсуі келесі параметрлермен анықталынады: өсу жылдамдығымен, құрғақ биомассалардың жылдамдығымен, экономикалық коэффициенттерімен. Өсу жылдамдығын салыстырмалы және абсолютті деп бөледі.
Өсірудің абсолютті жылдамдығы:
V= dx/dt, г/л · ч,
Мұндағы х- биомассалардың саны (немесе жасушалардың саны), г/л; t – уақыт, сағат.
Салыстырмалы жылдамдық өсіру шарттарының сонымен қатар организмдегі өтетін маңызды үрдістерді сипаттайды. Сонымен қатар биомассаның өсу жылдамдығының бірлігін биомассаның бастапқы бірлігіне айналдыру сипттамасын қарастырады. Мына формуламен есптеледі.
μ = dx/dt · 1/x
мұндағы μ – культура өсуінің салыстырмалы жылдамдығы.
Экспоненциалды фазадағы өсу популяциясының салыстырмалығын мына формуламен септейді
Х = x0e μ max t,
мұндағы х- биомассалардың саны (немесе уақыттың бастапқы кезіндегі жасушалардың саны), e-натуралды лагорифмнің негізі.
Бұл салыстырмалықты логорифмдеу кезінде келесі формуланы алуға болады.
Ln x = Ln + μmax t,
Бұл жағдайда биомасса санының лагарофимі немесе жасушалардың саны тұрақты жылдамдықпен екі еселенеді. Сол себепті бұл фазаны логарифмді деп атайды.
Қарқынды өсу нәтижесінде және қоректік ортада микроорганизмдердің көбею барысында тіршілікке қажетті өнімдер жиналады.
Метаболиттердің бөлінуі және жасушаларға қоректік заттардың түсуі жақсарып кеңістікті шектеулік қалыптасады. Өсу жылдамдығы төмендеп, жасушалардың бөліну саны азайып келесі фаза басталады.
3-ші фаза стационарлық фаза. Бұл фазада тіршілікке қабілетті және өлі жасушалар бір-бірімен теңеседі, яғни биомасса өсуі тоқталады.
dx/dt=0.
Әдетте айта кететін жағдай санаулы уақыттан кейін, бұл фазада аздаған мөлшерде биомассалардың өсуі байқалады. Яғни кейбір жасушалар әліде болса өсу қабілеттіліктерін сақтап қалады. Бірақ бұл үрдісте жасушалар өліп, кейіннен кейбір жасушалар автолизге ұшырайды.
Станцинарлық фазаға жеткен култураларда биомассалардың және жасуша сандарының максималды мөлшері жиналады. Осындай максималды көрсеткіштерді биомассалардың шығуы немесе жиналуы деп атайды.
4-ші тоқырау немесе өлу фазасы. Бұл фаза өлген жасушалардың санының көбеюінен басталады. Бұл фаза микроорганизмдер жасушаларына қолайсыз болып табылады.
Кезендік үрдістердің өнімділігі 1 сағатта 1 литр ортада өнімнің грамм бойынша алынуымен сипатталады. Микроорганизмдерді үздіксіз және кезендік өсіру әдістері көптеген өндірістерде себінді материалдарын алу сатыларында қолданады.
Микроорганизмдерді үздіксіз өсіру. Бұл өсіру тәсілі сандық және сапалық қатынасында экспоненциалды фазасында микроорганизмдерді тұрақтандыруға қажетті қоректік заттарды ферментаторға үздіксіз түрде жіберумен сипатталады. Қоректік заттардың үздіксіз берілуіне сәйкес жасушалар үздіксіз және біркелкі жылдамдықпен көбейеді. Бір мезетте ортаның жарты бөлігі жасушалармен бірге ферментатордан шығып кетеді. Ал ондағы микроорганимдердің саны үнемі сонда қалып отырады.
Үздіксіз өсіру жүйесін әсер ету принципі бойынша ашық және жабық түрлері бойынша жіктеуге болады. Олардың басты айырмашылығы ашық түрінде жүйедегі қалыптасқан жылдамдықтытың әсерімен жасушалар ағып жатқан қоректік ортамен шайылып кетеді, ал жабық түрінде жасушалар жүйеде тұрақтап кдідіреді де олардың саны өсе бастайды.
Үздіксіз өсірудің ашық түрін гомогенді-үздіксіз және гетерогенді-үздіксіз типтеріне ажыратуға болады.
Гомогенді-үздіксіз типінде қоректік заттардың концентрациясын, микроорганизмдердің өсу жылдамдығын уақыт бойынша тұрақттандырады, ал гетерогенді-үздіксіз үрдісі ферментатор жүйесін арнайы тоқ желісіндегі батареямен байланыстырады.
Кейбір микроорганизмдер сұйық және газды фазада немесе сұйық және қатты фаза шекраларында жақсы өніп өседі. Бұл жағдайларда аталмыш фазалардың беткейінде қалың тозаң қалыптасады. Мұндай фазаларды пинициллинді өндіретін зең сағырауқұлақтарын, лимон қышқылдарын және ферменттері өсіру барысында қолданады.
4Эмбриондарды көшіріп қондыру және сақтау. Қазіргі кезде эмбриондарды ұзақ және тиімді сақтау әдістерінің бірі тереңдік қатыру (криоконсервілеу). Бұл әдіс эмбриондарды алыс жерге тасымалдауға бір мезетте егіздердің санын жоғарылатуға мүмкіндік береді. J. Ozil (1983) эмбриондарды тереңдік қатыру үшін бластоцид сатысындағы 8 тәуліктік эмбриондарды қолдану қажеттігін баяндаған.
Ал 1983 жылы американдық ғалым H. Lehn-Jensen эмбриондарды тереңдік қатыру бойынша зерттеу жұмыстарын жүргізген. Ажыратылған 6-5 тәуліктік эмбриондарды екіге бөліп, ал олардың бөлшектерін агарлы цилиндрге салып, кейіннен тірі қойдың лигерленген жұмыртқа түтігіне ауыстырған. 24-48 сағаттан кейін эмбрион бөлшектерін ажыратып, содан соң моруланың тығыздалған даму кезіндегі немесе ерте бластоцид сатысындағы эмбриондарды 10% глицерин қосылған фосфатты тұз ерітіндісінде қатырады. Фосфатты тұз ерітіндісіндегі глицериннің концентрациясын әр 10 мин. сайын жоғарылатып отырған (3,3%-тен 10% дейін). Ал эмбриондары бар агар бөлшектерін 0,3 мл қатырғыш ортасы бар маркирленген пайеттерге салады.
Бастапқыда қатыру режимінің жылдамдығы 10С/мин -60С өткізілсе, ал кристалданғаннан кейін жылдамдығы 0,30С/мин ауыстырылса, ал қатыру 350С дейін жоғарылатылды. Содан кейін пайеттерді Дьюар ыдысындағы сұйық азотқа салады. Пайеттерді жібіту үрдісі су моншасында қыздырылу арқылы іске асырылған. Ал фосфатты тұз ерітіндісіндегі глицерин концентрациясын арасына 10 мин салып 4 рет шаю арқылы төмендеткен. Барлығы 37 эмбрион қатырылып, оның ішінде 26-сы, яғни 70% өміршеңдігін сақтап қалған. Хирургиялық жолмен трансплантацияланған 18 эмбрионның 11-нен тірі бұзау алынып, соның ішінде 4 сыңарынан бір жұмыртқалы егіздер шыққан.
L. Piccard et al (1984) агарлы пластиналарды қолдану арқылы қатырылған және ерітілген эмбрион бөлшектерін өсіру үшін тәжірибе жұмыстарын жүргізген. 29 эмбрионның 14 агарлы цилиндрде қатырған. Жібітуден кейін 70 % эмбрион бөлшектері 24 күндік өсіруден кейін ары қарай дамуын жалғастырған. Ал агар цилиндрлері қолданылмай қатырылған эмбриондардың ішінен тек қана 6 % өміршеңдіктерін сақтап қалған. Авторлар жүргізген зерттеулерін қорытындылай келе эмбриондарды ұзақ мерзімде сақтау үшін агарлы цилиндрлерді қолдану әдісінің тиімділігі жоғары болатындығына көз жеткізген.
Эмбриондарды көшіру тиімділігі зиготаларды сақтау жағдайына тікелей байланысты. Эмбриондарды консервациялаудың болашағы бар әдісіне терең мұздатуды жатқызуға болады (-196°С-да сұйық азотта криоконсервациялау).
Терең мұздатылған эмбриондарды ұзақ уақыт сақтаудың бірқатар артықшылықтары бар:
үлкен табындар мен реципиент топтарын ұстау қажеттілігі туындамайды, өйткені донордан алу мерзіміне қарамай-ақ кез келген уақытта көшіру жасалына алады, бүл көшіру рентабелділікті жоғарылатады.
криоконсервация генетикалық бағалы жануарлардан эмбрион банктарын құруға, сонымен қатар сирек, құрып бара жатқан тұқымдардың гендік қорын сақтауға, эмбриондарды әлемнің кез-келген еліне жеткізуге мүмкіндік береді.
Саулық донордан эмбрионды 4-5 күндері хирургиялық әдіспен алады. Операция алдында саулықты 24 сағат аш ұстайды. Малды арнайы столға шалқасынан жатқызып байлап бекітеді, операция алаңын дайындап болған соң желінінің алдынан 2-3 см. жоғары алып қалдырып құрсақты дәл ортасындағы ақ қарын сызығының бойымен 5-3 см. етіп тіледі. Орындаушы саусақтарымен жатырды тауып алып, оны терінің сыртына тартып шығарады, содан соң жатыр тармағына шприц арқылы Дюльбек сұйығын жібереді, ал ұрық жолына салынған капсула арқылы ағып шыққан сүйықты эмбрионмен бірге көлемі І40-150 мл шыны цилиндрге жинап алады. (Ж. Өтемісов, Қ.Қасымов, әдісі бойынша, 1991ж.)
Эмбриондарды тасымалдау әдістерін қолданғаннан бері, олардыалып қондыру аралығында сақтаудың пайымды жолдары ізделуде. Өндірістік жағдайда эмбриондарды таң кезінде алса кешкілікке дейін тасымалдап қондырады. Осы аралықта эмбриондарды сақтау үшін құрамына ірі қара мал сары суы қосылған бірнеше түрлі фосфатты буферлер қолданып үй температурасында, не болмаса 37°С сақтауға болады.
Ірі қара мал эмбриондарын, 24 сағат бойы ұрықтану белсенділігін төмендетпей өсіруге болады. Шошқа эмбриондарының, осы 24 сағат ішінде белсенділігін жоймай жақсы жанданғаны байқалған.Эмбриондардың тіршілік қабілетін әлде қайда жоғарлатуға болады егерде қоршаған орта температурасын төмендеткен жағдайда, ал эмбриондардың температуралық сезімталдығы әр малда әр түрлі әсіресе шошқа ұрықтарының.Осы күнге дейін ірі қара мал мен шошқа эмбриондарының алғаш даму сатысында, тіршілік қабілетін 10-15°С-ден төмендетіп сақтау мүмкін болмай тұр (С. Полдж, 1982).
Қой ұрықтары бірінші не екінші жасушалық кезеңдерден бастап бластоциттерге айналғанға дейінгі мерзімде, жалпы, қай кезеңде болсын 0°С бастап салқындатуды жақсы көтереді. Ұрықтарды, сақтау температурасы 37°С., 10°С., не болмаса 0°С төмендесе, ұрықтың даму үрдісі баяулап тек 5-6 тәулік аралығында сақтауға болады.Ұрықты ұзақ мезгіл сақтау үшін олардың даму үрдісімен қатар, алмасу үрдістерінде толығынан тежеу не болмаса тоқтатқан жөн. Ұрықтардың бұл күйі температура -195°С не болмаса одан да жоғары болу керек.
Соңғы жылдар бойы жасалып жатқан эксперименттер нәтижесінде ірі қара мал ұрықтарын салқындату мен қайта еріту жылдамдығының оптимальды қатынасы анықталды. Егерде ұрықтарды (–50°С-ден төмен) саябыр (мин/1°С.) салқындатып сұйық азотқа салатын болса, еріту жылдамдығы да баяу өткені қажет (мин/25°С. не оданда баяу). Жылдам еріген кезде мұндай ұрықтар жылдам бұзылып, тіршілік қабілетін жояды. Ұрықтарды керісінше, азотқа салар алдында, баяу (мин/1°С.) мұздатып қатыратын болса (-25 и 40°С), онда жылдам ерітуге болады (мин/300°С). Осы кезде, су қалдығы азотқа салғаннан бастап қатып, шыны тәрізді күйге ауысады – транформациялады (С. Вилладсен, 1980). Бұл факторлардың анықталуы ірі қара мал ұрықтарын мұздатып қатыру және жылдам ерітуге жол ашты. Ұрықтарды шәует тәрізді, көшіріп - қондыру алдында, 35°С жылы суда - 20 с. ішінде, арнайы құралдар қолданбай ақ ерітіп алып трансплантациалауға болады.
Арнайы паеттерде мұздатылып қатырылған ұрықтарды, сол пакет ішінде бір ретте ерітіп, араластыруға болады. Мұздатылып қатырылған ұрықтарды криопротектор ерітіндісінен алып, құрамында сахарозасы бар, гипертоникалық ерітінді ортасына салады, осы кезде криопротектор қалдықтары жасушаның осмостық теңдігін бұзбай (глицеринің 0,02 мл 1,5 М) бірте-бірте ұрықтан шығарылады.
Өндірісте, малды 0,02мл.көлемінде ұрықтандыру үшін, ұрықтарды 0,25 миллилитірлік пасталарға орналастырады. Арнайы ауа көпіршіктері арқылы паетті үш камераға бөледі: біріншісінде - криопротектор ерітіндісі; екіншісінде - криопротектор ерітіндісіндегіұрық; үшіншісінде - ерітінді (1,08 М сахароза ерітіндісі). Мұздатып қатырып соңында еріткен кезде пает құрамын сілкіп араластырады да реципиент организміне ұрықты хирургиялық қатынассыз ақ күнделікті малды қолдан ұрықтандыру тәрізді алмастырып көшіруге - трансплантациялауға болады.
Тұнғыш рет 1974 жылы С.Вилладсен және т.б., қой ұрықтарын мұздатып қатырып соңында еріту әдістерін ашқан. Ұрықтарды баяу салқындатып (мин. 0,3-2,0°С), баяу еріту арқылы (мин. 4-25°С.). Криопротектор ретінде диметилсульфоксид-ДМСО қолданылған. Алғаш құлын, овуляцияның алтыншы күнінің 11 мұздатылып қатырылып соңында ерітілген ұрықтардан алынған.
Сонымен, ірі қара мал,қой ешкі, жылқы ұрықтары морула мен бластоциста кезеңінде мұздатып қатырылуы кең диапазонында болады - (196°С). Шошқа ұрықтары ешқандай диапазонда мұздатып қатыруға келмейді.
Сүт қоректілер ұрықтарын мұздатып қатыру кезеңінде, ұрық тіршілік қабілетін сақтап қалуда пеллюцид аймағы айтарлықтай рөл атқарады. Қоршаған ортада мұз кристалдарының пайда болуынан, сұйықтықтың осмостық қысымы жоғарлап, соңында тұздары ұрық ішіне кіруінен кейін, суы шығып теңеседі.
Био үлгілерді баяу мұздатып қатыру не еріту кезінде, жасушада өтетін процесстер болса бір қалыпта, бұзылмай өтеді, жасуша өз тіршілік қабілетін сақтайды.
Ауыл шаруашылық малдарының ұрықтарын төмен температурада сақтап консервілеу, көп реципиент малдар басын бақпай, бірнеше жылдар бойы өнімділігі жоғары, сапалы мал генофондтарын сақтап қалуға, ұрықтарды экспорттауға не импорттауға мүмкіншілік береді.
Ұрықтарды мұздатып қатырып сақтап кейіннен еріту кезінде бір есте сақтайтын ерекше жағдай, ұрықты салқындату жылдамдығы, бұл көрсеткіш көп жасушаларға минутына 1°С құрайды.
Ұрықты мұздату механизмі. Ұрықтарды температураны төмендетіп салқындатып мұздату кезінде алдымен, жасушаны қоршаған ортада мұз түзіледі. Температураны төмендеткен сайын экзоцеллюлярлы мұз мөлшері жоғарлай бастайды да қалдық ерітіндідегі тұз концентрациясы да жоғарлап отырады. Бұл кезеңде осмостық реакция арқылы жасушадан қоршаған ортаға су бөлініп өтіп теңдесу қалыптасады.
Жасушаны баяу мұздатқан жағдайда температура төмендеген сайын оның бойынан су қоршаған ортаға шыға бастайды да осмостық қысым экзоцеллюлярлы ерітінді күйіне теңдескен кезде тоқтап ерітінді ұрығымен бірге мұздап қатады. Жасушаны жылдам мұздатып қатырған кезде, жүйе осмостық қысым деңгейін реттей алмағандықтан жасуша құрамы салқындап, оның ішіндегі су кристалданып қалады. Мұздың осы ретте эндоцеллюлярлы түріне айналуы, ұрықтың өлу себептерінің бірі болып саналады.
Жасушалар мен ұлпаларды мұздатып қатырудың мақсаты – олардың метаболитті (тіршілік) үрдісін ішкі құрылымын зақымдамай сақтап қалып,қайта қалпына келу күйде тоқтату.
Өндірісте ірі қара малдардың ұрығын үш кезеңде үй температурасында 0,5 M и 1,0М диметилсульфоксид (ДМСО) ерітінділерінде 10 минуттан, жеке-жеке, ал 1,5 М ерітіндісінде 20 мин, қанықтырылған соң, күрт жылдам - 6°С дейін, жылдамдығы минутына 1 °С-та салқындатылып, одан әрі -36°С жылдамдығы 0,3°С және минутына 0,1°С -60°С, мұздатылған соң, био объектіні сұйық азотқа салып ұзақ мезгілде сақтайды.
Мұздатылған ұрықты еріту механизмі. Ұрықтарды еріту кезінде жасуша бетімен, қоршаған орта шекарасында концентрациялық градиент түзіліп, босаған су жасушаның ішіне ығысады.
Ұрықты жылдам және баяу еріткен кезде іштегі мұз кристалдары еріп жасушаға теріс әсерін тигізеді.Осыған орай, ғалымдардың тұжырымы бойынша жылдамдығы минутына 0,3 °С та -35°С дейін екі сатыда мұздатқан соң ампулаларды сұйық азотқа салған өте пайымды деп есептелуде.
Эмбриондарды мұздатып қатыруға дайындау реті. Эмбриондарды қысқа мерзімде сақтау үшін арнайы қоспалары бар Дюльбекконың фосфатты- тұз ерітіндісін қолданады. Эмбриондармен жұмыс жасауға ыңғайлы болған соң, жақсы жуылып,кептіріліп залалсыздандырылған арнайы сағатты шынылар алады. Ерітінді буланып, құрғап кетпесін деп Петри шыныларының түбіне сумен ылғалдандырылған сүзгіш қағаз салады да оның бетіне 3-5 мл ерітінді құйылған шыныны орнатады.
Іріктеліп,бағаланып алынған мұздатылуға қатырылуға келіп түскен эмбриондарды Дюльбекконың фосфатты-тұз ерітіндісі негізінде жасалған диметилсульфоксид (СН2)SО4 (ДМСО) ерітіндісінде сақтайды. Ерітінділер 4 сатыда, әр түрлі - 0,25М; 0,5М; 1.0М; 1,5М дәрежелерінде араластырылған болып дайындалады. Мұздатып қатыру алдында эквилибрация өткізеді, бұл процесс бір сатыдан келесісіне жоғарлау арқылы, ал еріткен кезде, жоғары сатыдан төмен қарай өткізіледі. Әр бір ерітіндіде эмбриондарды 5 минуттан, ал соңғы ерітіндіде 15 минут ұстайды. Эквилибрация сатысынан кейін эмбриондарды салқындататын қондырғыларға салып қажетті режимде мұздатып қатырады. Мұздатып қатыру кезінде эмбриондарды 30 минут 10 % глицерин ерітіндісінде ұстаған кезде жақсы нәтиже бере алғаны анықталған.
Эмбриондарды арнайы ерітінділер құйылған, көлемі 50x60 мм пробиркаларға орналастырып, фольга қағазымен орап жауып салқындатады, не болмаса жалпы көлемі 02-03 мл ампулаларға құйып аузын балқытып жауып, салқындататын машинаға салады.
Эмбриондарды арнайы жіңішке, көлемі 4x125 мм түтіктерге (соломинка) салып қатырады, не болмаса көлемі 50x5 мм, фольга қағазымен оралып жабылған пробиркалар қолданады. Әрбір пробиркаға екі эмбрионнан артық орналастыруға болмайды, себебі бір реципиентке екі эмбрион салу керек.
Дюльбекко ортасын даярлау реті. Тұзды ерітінді даярлау үшін үш дистилденген су алынады, оған келесі ретте құрамына кіретін химиялық таза реагенттер ерітіледі: хлорлы натрий (NaCl) 8 г, хлорлы калий (КCl) 0,20 г сусыз ауыстырылған күкірт қышқылды натрий (Na2 НРО4) 1,15 г, күкірт қышқылды калий (КН2РО4) 0,20 г, құрамына судың 6 молекуласы кіретін хлорлы магний (МgCl 2 ×6 Н2О) 0,10 г, хлорлы кальций (СаCl) 0,10 г, натрий пируваты 0,036 г, глюкоза 1,00 г ерітіндіге әрбір реагентті белгілі ретте қосып отырады. Ерітінді көлемін рН -7,2-7,3 тең 1 литрге дейін жеткізеді. Ерітіндінің осмостық қысымы 290 миллиосмоль. Дайын ерітіндіні стерильді пластинкалардан сүзіп өткізу арқылы залалсыздандырады, мысалға ЕКС -2 Зейтц фильтрлері (ФРГ). Ерітіндіні үй температурасында сақтайды.
Эмбриондармен жұмыс істер алдында ерітіндіге келесі компоненттер қосады: ірі қара мал қан сарысуының альбумині (леофильденген)- 4 мг/мл, пеницилиннің натрий тұзы – 100 МЕ/мл.
Эмбриондарды реципиентке көшіру.Эмбрионды операциясыз да, операция жасап та қондыруға болады. Сиырларға қазіргі таңда барлық елдерде эмбрионды операциясыз қондыру кеңінен тараған. Ол малды қолдан ұрықтандырудың ректоцервикальді әдісіне негізделген. Ол үшін «Нойштадт» (ФРГ), «Кассу» (Франция) катетрі қолданылады. Катетердің ішіне эмбрион орналасқан арнайы микро түтікше салынады. Түтікшенің диаметрі -1 мм, көлемі-0,25 мл.
Реципиентті де донорды дайындағандай ретте дайындайды, мал күшенбеу үшін және катетерді жатыр тармағына енгізуді жеңілдету үшін 10-15 минут бұрын сакральді жансыздандыру - анестезия жасайды.
Ректоцервикальді әдіспен катетерді қынаптың үстіңгі қабырғасымен жатыр мойнына, одан ары жатыр тармағына тереңдетіп енгізе береді. Катетер жатыр тармағының ұшына жеткен кезде катетердің стилетін итеріп шығару арқылы түтікшенің ішіндегі эмбрионды жатыр ішіне түсіреді. Эмбрионның жатырға телініп, әрі қарай өсіп — дамуы әзірше 50 пайыздан аспайды.
Жатырдың кілегей қабығы аздап қана жарақаттанатын, қан шығатын болса, ол эмбрионның телініп, өсіп - дамуына ешқандай үміт жоқ екендігін білдіреді. Эмбрионды көшіріп қондырғаннан кейін 2-ай өткен соң буаздықты тік ішек арқылы қол салып анықтайды.
5 Каллус ўлпасы жасуша өсіндісінде жоғары сатыдағы өсімдіктерде кездесетін жасушалардың мамандану ќабілетінің жойылуына байланысты пайда болады. Каллус ўлпасы өте сирек жағдайда, өсімдік заќымданғанда пайда болады. Бўл ўлпа заќымданған жерді ќорғап, мүшені ќалпына келтіру үшін ќоректік заттарды сол жерге жинайды. Арнайы ўлпа жасушаларының бөлінуге ќабілеті пайда болған кезде каллус ўлпасы түзіледі (1-сурет).
Жасуша заќымданғанда оның жауабы ретінде төзімділік пайда болады. Ќоректік ортаға кез келген ўлпаның бөлігін немесе эксплантты енгізгенде де, каллустың түзілуін байќауға болады. Эксплант дегеніміз – каллус ўлпасын алу їшін ќоректік ортаға отырғызылатын өсімдіктің алєашќы бір бөлшегі.
Біраќ эксплантќўрамында физиологиялыќ белсенді заттар аз болєандыќтан каллус ўлпасы пайда болуы үшін ќоректік ортаєа ќоздырғыш ретінде фитогормондарды ќосады.
2-сурет. Жасуша шеңберініѕ сызба нўсќасы: S - ДНЌ-ныѕ түзілу кезеңі, G1 - ДНЌ-ның түзілуіне дайындыќ кезең, G2- түзілудің соңы, М – митоз кезеңдері: П-профаза, Мґметафаза, А-анафаза, Т- телофаза,С –цитокинез R1R0- тыныштыќ кезеѕі, D - жасушаның мамандану кезеѕі.
Маманданған эксплант жасушаларын ќоректік ортаға отырғызған кезде олардың зат алмасуында өзгерістер байќалады, бўл негізінен жасушалардың заќымданғаннан кейін бөлінуге дайындалғандығына байланысты (2-суретте жасушаныѕ бөліну сызба нўсќасы көрсетілген).
Болжамдар бойынша, жасуша заќымданған кезде олардың бөліну үрдісін ынталандыратын ќоздырғыштар - элиситорлар тїзіледі. Бўл зат жасуша ќабығының полисахаридтерінің ыдыруынан пайда болады. Элиситордың арќасында маманданєан жасушалар өз мамандыєынан тез айрылып, белсенді гендердің өзгеру нәтижесінде ќор заттардың жиналуына, пластид аппаратының ќайта ќўрылуына, РНЌ –ның барлыќ түрлерінің және ДНЌ түзілуіне, антиген - ўлпа аќуызының жоғалуына және жасушаның бөлінуіне ќажетті аќуыз пайда болады.
Осы ќўбылыстардың нәтижесінде пайда болған каллус ўлпасы жўќа ќабыќты, әр түрлі көлемді паренхимдік жасушалардан тўрады. Бўлар созылу кезеңінен өтіп және жаңадан бөлінуге дайын жасушалар.
Каллус ўлпасы тығыздылығына байланысты борпылдаќ, тығыз немесе орташа тығыз болады. Борпылдаќ каллус тез өседі жјне сўйыќ орта /суспензия/ дайындауға ќолайлы. Тығыз каллус ўлпасын екінші мамандану арќылы тўтас өсімдік алу үшін пайдаланады.
Каллус пайда болуы үшін алғашќы кезде ќоректік ортада ауксиннің мөлшері, оныѕ өсу кезіндегі көрсеткішінен бірнеше рет жоғары болуы шарт. Мысалы, каллустың пайда болу кезінде ортаға 2-3 мг/л 2,4-D ќосу ќажет болса, ал оныѕ өсуін ќолдау їшін 0.5- 1.5 мг/л 2,4 D жеткілікті /эксплант түріне байланысты/.
Каллус ўлпасының өсуін саќтау үшін (јрбір 4-6 аптадан соѕ) ўлпаның бір бөлігін залалсыздандырылған жағдайда саќтай отырып, жаңа ќоректік ортаға ауыстырады, бўл үрдісті көшіру немесе пассаж жасау дейді. Осылай каллус ўлпасын ўзаќ уаќыт /оншаќты жылдар бойы/ саќтауға болады. (лпаны бірнеше рет пассаждан өткізуге/ көшіруге/ болады. Біраќ көп рет пассаждан өткен каллус “үйреншікті” жағдайға ўшырайды. Нәтижесінде гормондыќ тәуелсіздік пайда болып, каллус ўлпасының тўтас өсімдікті ќалпына келтіру ќасиеті жойылып кетуі мїмкін.
Өсудің жылдамдығына байланысты каллусты ќайта отырғызуды /пассаждауды/ 28-30 күн сайын жүргізіп отырады. Өсіру кезеңі орташа 4 аптаєа тең. Каллус ўлпасының жаңа ќоректік ортаға ќайта отырғызуға арналған бөлігін енді эксплант емес, оны трансплант деп атайды.
Каллус ўлпасы пайда болу үшін эксплант ретінде ґсімдіктіѕ әр түрлі мүшесін: тамыр, өркен, жапыраќ, тозаңќапты және т.б ќолдануға болады (3- сурет).
3-сурет. Эксплант ретінде ќолданылатын өсімдіктің мүшелері көрсетілген ( Муромцев, Бутенко, 1990).
Каллус алу їшін жетілмеген, жас ўлпаларды пайдаланған жөн. Мысалы, ўрыќтанудан 8-10 күн өткен соѕ алынған жүгерінің эндосперм эксплантынан каллус пайда болмайды.
Алғашќы экспланттың өлшемі каллустың өсуіне әсерін тигізбейді, біраќ ең аз мөлшердің шегі болады, оны азайтќан жағдайда эксплантты өсіру мүмкін емес. Мысалы, сәбіз тамырының флоэмасынан алынған массасы 3,8 мг экспланттар өсуге жарамды болса, осындай мөлшерде жер алмўртынан алынған эксплант жарамсыз. Оның себебі сәбіз жасушалары ўсаќ болғандыќтан, эксплантты кескен кезде олар көбірек заќымданады.
Каллус жасушалары өсу кезінде бөлініп, өсіп, маманданып, соңында өсуі тежеліп, тоќтайды. Каллус ўлпасының өсуі ќалыпты жасушалар сияќты S- әрпі тәрізді сызба нўсќасымен бейнеленеді (4-сурет). әдетте, агарланған 20-40 мл ќоректік ортаға отырғызылатын масса 60-100 мг тең.
4-
сурет.
Каллус
ўлпаларды мерзімдік ґсіру барысында
ґсу айналымныѕ S–тјрізді
ќисыєы.
Ґсу
кезеѕдері: 1 – латенттік (пјрмендену)
2 – логарифмді (ќарќынды ґсу); 3 – тўраќты
ґсу; 4 – баяу ґсу; 5 – стационарлы (бір
сарынды)
Осы мөлшердегі экспланттың үлкен бөлігі 3-8 апта ішінде ќайта отырғызуға жеткілікті каллус түзеді. Осы каллусты әрі ќарай өсірген кезде, генетикалыќ жјне физиологиялыќ ерекшеліктері бар жасуша штаммы түзіледі.
Жекелеген жасушаны өсіру. Каллус ўлпасы өсімдік ағзасынан тыс пайда болғандыќтан генотиптік және фенотиптік өзгерістерге ўшырайды да, жаңа жасуша линияларының пайда болуына себеп болады. Осыған байланысты белгілі линияны немесе мутантты сўрыптап алу үшін жеке жасушаларды өсіру әдісін меңгеру ќажет. Жекеленген жасушаларды, өсімдіктерді жаќсарту үшін әр түрлі салада ќолдануға болады (5-6 сурет).
5-сурет. In vitro технологияларын өсімдік шаруашылығында ќолдану (Г.Ж. Валиханова, 1996).
6 –сурет. Биотехнологиялыќ әдістер арќылы өсімдіктердің генетикалыќ жағдайын жаќсарту (И.Раќымбаев,1993)
*Кесте Г.Ж Валиханованыѕ оќулыєынан алынєанына байланысты клетка термині бўл жерде аударылмаєан
Жеке жасушаның көзі ретінде ќоректік ортада өсетін жасуша суспензиялары, бөлінген ўлпалар, жекеленген протопласттар есептелінеді. Жеке жасушаларды өсіру арќылы бір жасушадан тїзіліп басталатын өсімдік клонын алуға болады. Егер өсімдік жасушасының каллусын тығыз ќоректік ортаға жеке орналастырса, ол микроағзалар сияќты бөлініп колония ќўрмайды. Жеке орналасќан жасуша бөліну ќабілетінен айырылады. Сондыќтан жасушалардан клонды алу үшін мынадай тәсілдер ќолданған жөн: “күтуші ќабат” / культура няньки/, “ќоректендіруші ќабат” /кормящий слой/ жјне «микротамшыда» өсіру әдісі.
“Күтуші ќабат” әдісінің мәні мынада - тығыз ќоректік ортаға, жеке каллус жасушаларыныѕ арасына 4-5 мм ќашыќтыќќа сол өсімдіктің, жылдам өсіп келе жатќан каллус ўлпасының бөлігін орналастырады. “Күтуші ќабат” ўлпасы жеке жасушаның бөлінуіне, әрі ќарай дамуына ќолайлы жағдай туғызады.
“Ќоректендіретін ќабат” ќўру үшін жекеленген жасуша алынған өсімдіктен немесе соған ўќсас өсімдіктен жасуша суспензиясын ќолданады. Жасуша суспензиясы өсу кезеңінің алғашќы кезінде алынады. Аузы кең колбаға ќўйылған суспензияның бетіне орналасќан тор көмегімен жеке жасушалары бар сүзгіш ќағазды 7 суретте көрсетілгендей бекітеді. Жеке жасушадан пайда болған клонның мөлшері 0,5-1мм болєан жағдайда оны әрі ќарай өсіру үшін агарланған ќоректік ортаға ауыстырады.
“Микротамшы” әдісін ќолданєан жағдайда жеке жасушаларды аз мөлшерде /1мкл/, яғни бір тамшы көлемінде, сўйыќ ортаға арнайы пластикалыќ ыдысќа орналастырады. Жасушаның өсуі микротамшылардың орналасу тығыздығына байланысты.