5. Баска организмге тасымалданатын кажетті генді бөліп алу.

а) ДНҚ-донордан оны рестрикциялау арқылы. Рестрикция немесе нуклеотидтерді белгілі реттіктері бар бөліктерде ДНҚ-ны ыдырату - бүл рестрикциялайтын эндонуклеазалар арқылы жүзеге асады. Мүндайда ДНҚ-ның қос спиральді тізбегі комплементарлық арнадан ауытқып қиылатын болғандықтан, "сатыша" түзіледі - ДНҚ-ның бір тізбегі бірнеше нуклеотидтерге бөлектенеді. Бір тізбекті (жабысқақ) үштар түзіледі. Егер ДНҚ бөлігінің 2 жабысқақ бөлігі кездессе, оның үстіне олар тек бір рестриктаза әсерінен пайда болса, үштағы реттіктер комплементарлығы есебінен өзара қатынасқа оңай түседі:

б) ДНҚ-ның қысқа бір тізбекті бөліктерін (олигонуклеотидтер) химиялық синтездеу, нуклеотидтер арасында эфирлік байланыстарды біртіндеп түзеу жолымен және ДНҚ лигаза қатысуымен олигонуклеотидтерді өзара тігу арқылы хос тізбекті полинуклеотидтерді түзу;

в) ең жиі қолданатын әдіс - жасуша-донордың ДНҚ бөлігі емес, одан транскрипцияланған м-РНҚ-ны бөлу. м-РНҚ негізінде кері транскриптаза бөлігі (ревертаза) көмегімен комплементарлық ДНҚ тізбегі синтезделеді (кДНҚ), одан кейін кДНҚ-ға ДНҚ-полимераза қатысуымен екінші тізбек қүрастырылады. Осындай жолмен басқа организмге тасымалдауға керекті генді алады.

Гендерді тасымалдауға арналған векторлар. Бөтен генді клетка ішіне тасымалдап алып баратын арнаулы ДНҚ молекуласын вектор дейді. Оған мынадай талаптар койылады: 1) өз алдына репликациялану, яғни клетка ішіне бөтен генді алыл кірген соң клеткамен бірге немесе өз алдына көбейе алатын болуы керек; немесе вектор клетка хромосомасының құрамына еніп, онымен бірге ұрпақ клеткаларға беріліп отыруы керек; 2) трансформацияланған клеткаларды анықтау үшін оның ерекше генетикалык белгілері (маркерлері) болуы керек (мысалы антибиотикке төзімділігі); 3) құрамында рестриктазалар үзе алатын нуклеотидтер тізбегі болуы керек және репликацияға қабілетін жоғалтпауы керек; 4) векторға орналастырылған бөтен ген оның атқаратын қызметін бұзбауы керек, ал вектор болса, ол да епгізілген геннің ішінде дұрыс реттеліп жұмыс істеуін қамтамасыз ететін болуы керек; 5) вектордың көлемі кішігірім болуы керек.

Өсімдіктерге генді тасымалдау әдістері.

1) Өсімдік протопластарын трансформациялау. Өсімдік жасушасына «жалаңаш» ДНҚ-ны көшіргенде жасушаның қабықшасы кедергі жасайды. Сондықтан жасушаны ферментпен өндеп кабықшасынан босатады. Өсімдік протопластарын трансформациялағанда ДНҚ-ның жасушамен жутып алыну кезеңі қауіпті болып саналады. Өсімдік протопластарының нуклеазалары ДНҚ-ларды гидролиз арқылы ыдыратып жіберуі мүмкін. Сондықтан протопластар бар ерітіндіге цинк хлоридін қосса немесе рН мөлшерін жоғарлатса нуклеаза ферментінің белсенділігі төмендейді. Протопластар көмегімен ДНҚ-ны өсімдік жасушасына тасымалдау темекі дақылдарында кеңінен қолданылады. Бұл трансформанттардан толық өсімдік өседі және олар бөгде ген ақпаратын келесі ұрпаққа береді. Бүл әдістің артықышылығы мынада: бөгде ДНҚ-ны Т-ДНҚ құрамына енгізудің қажеті жоқ; «жалаңаш» ДНҚ-ны көішру әдісін астық дақылдарына да қолдануға болады.

2) ДНК, микроинъекциясы әдісі трансформацияланған өсімдік жасушаларын алу мүмкіншіліктерін кеңейтеді. Өсімдік жасушаларын микроинъекциялау үшін электрод түтіктерінен жасалған инелерді қолданады. Әрбір протопластқа инъекция мөлшері 10^-8-10^-2 мл болу керек. 2-5 күндік протопласт өсіндісінде микроине арқылы бір тамшы буфер ерітіндісі енгізіледі. Бұл тамшыдағы ДНҚ мөлшері 9,1-1,0 мкг/л. Бұл әдіспен өсімдік жасушасын трансформациялау өте тиімді (10-20%). Трансформациялауға сәйкес жағдайлар туғызған кезде, бөгде ДНҚ-ны цитоплазмаға емес ядроға енгізсе микроинъекция әдісінің тиімділігі 1000 есе артады. Бұл жағдай ядролық мембрана бөгде ДНҚ-ны енгізуге бөгет жасайтынын көрсетеді.

3) Электропорация әдісі - биомембраналардың өтімділігін күшейтетін жоғары кернеулі электр өрісіне макромолекулаларды енгізу. Электропорация әдісі арқылы өсімдік цротопластар трансформациясының тиімділігін арттыруға болады. Электр тоғымен өндегеннен кейін жасуша мембранасының саңылаулары арқылы электропорация ортасындағы ДНҚ молекулалары жасушалармен жүтылады. Содан соң протопластарды үйлесімді ортаға отырғызады. Тасымалдау тиімділігі электр шоктан кейін 24-48 сағат өткен кейін анықталады. Электрпорациядан кейін тірі қалған жасушаларда геннің енгізілгенің талдайды. Электропорация әдісін даражарнақгы жэне қосжарнақты өсімдіктрге қодцануға болады.

4) ДНҚ-ларды липосомаларга түю әдісі. Өсімдіктер протопластарына енгізілген гендерді қорғау үшін липосомаларды қолданады. Липосомалар - қабықшалары фосфолипидтерден түратын сфералық денелер. Липосомалардың мембранамен жабысу жэне жасушалармен жутылу кабілетіне байланысты, оларды жасуша өсіндісіне енгізу үшін қолданады. ДНҚ-ларды липосомаларға түю нуклеаза әсерінен қорғайды, сондықтан оларды әртүрлі өсімдіктер үшін қолданады. Липосомалар көмегімен генетикалық ақпаратш өсімдік жасушасына тиімді енгізу үшін келесі факторлардың мәні өте зор. Олар: ПЭГ концентрациясы, инкубациялық буфердегі металл иондарының концентрациясы, рН, липосомаларды протопластармен инкубациялаудың қолайлы уақыты, липосомалардың қолайлы уақыты.

5) биобаллистика әдісі-вольфрам (алтын; күміс) шариктері арқылы генді «генная пушка» арқылы ядроға енгізеді.