Получение метаболитов и приготовление стандартных растворов (на примере хлордиазепоксида)

Для приготовления стандартного раствора использовали, хлордиазепоксид (7 – хлор – 2 диметиламино – 5 фенил – 3н – 1,4 – бензодиазепин – 4 - оксид). 0,050 г препарата растворяют в 96⁰ спирте, объём раствора доводят в мерной колбе до 50 мл (1 мг/мл).

Демоксепам (7 – хлор – 2 – диметиламино – 5 – фенил - 3н – 1,4 – бензодиазепин – 2ОН - 4 - оксид) был получен из 7 – хлор – 2 – (метилацетамид) – 5 – фенил – 3н - 1,4 – бензодиазепин – 4 – оксида: к 0,25 мл раствора последнего добавляют при комнатной температуре 250 мл 1Н раствора соляной кислоты. Через 14 часов смесь подщелачивают и экстрагируют равным ? эфира дважды (для очистки). Продукт реакции ? и экстрагируют метиленхлоридом. Органический растворитель удаляют, полученный остаток перекристаллизовывают из петролейного эфира. Выход 89%. Чистое вещество в виде пластинок с t плав.=235-236⁰С. Препарат растворяется в щелочах с образованием кристаллических солей. Чистоту определяют хроматографически в системе этилацетат – абсолютный спирт (9:1). Полученное соединение используют для приготовления стандартного раствора: 0,050г демоксепама растворяют в 96⁰ спирте и объём раствора доводят до 50 мл (1 мг/мл).

Дезоксидемоксепам (7 – хлор – 5 – фенил - 3н – 1,4 – бензодиазепина – 2ОН) получают из демоксепама: 14,3 г последнего растворяют в 300 мл диоксана. Гидрируют в присутствии 20 г никеля Ренея под давлением при нормальной температуре до поглощения ? водорода. Полученную соль фильтруют и концентрируют, упаривая под вакуумом до минимального объёма. Остаток растворяют в диэтиловом эфире или петролейном эфире. После перекристаллизации из ацетона образуются бесцветные пластинки с t плав.= 216 – 217. Выход 92%. Чистоту полученного препарата определяют хроматографически в системе этил-ацетат – абсолютный спирт (9:1). Для приготовления стандартного раствора растворяют 0,050г полученного соединения в 96⁰ спирте и объём раствора доводят в мерной колбе до 50 мл (1 мг/мл).

2 – амино – 5 – хлор – бензофенон (АХБ): К измельчённым таблеткам хлордиазепроксида в круглодонных колбах для гидролиза добавляют 10 мл 6н. раствора соляной кислоты и гидролизуют на глицериновой бане при температуре 120-130⁰С в течение 30 минут. По охлаждении, гидролизат нейтрализуют гранулированным едким натром и устанавливают рН 10. Экстрагируют равным объёмом хлороформа дважды. Органический растворитель удаляют на роторном испарителе. Остаток подвергают очистке в тонком слое силикагеля (подвижная фаза - бензол). Участок сорбента, содержащий 2 – амино – 5 – хлорбензофенон (окрашенный в жёлтый цвет), элюируют ацетоном по 5 мл 4 раза. Органический растворитель удаляют и остаток высушивают до постоянного веса при t = 70⁰. Кристаллический порошок жёлтого цвета с с t плав.= 96,5⁰С. 0,050г 2 амино – 5 – хлор – бензофенона, помещённого в мерную колбу на 50 мл, растворяют в 96⁰ спирте и объём доводят до метки (1мг/мл).

Частные методы исследования веществ группы 1,4-бенздиазепина

ХЛОРДИАЗЕПОКСИД

Хлордиазепоксид (элениум, декадил, либриум и др.) представляет собой белый или светло-желтый кристаллический порошок, хорошо растворяется в воде. Он экстрагируется органическими растворителями из щелочной среды. Лактам, являющийся метаболитом хлордиазепоксида, экстрагируется диэтиловым эфиром из нейтральной и кислой среды.

Метаболизм. Хлордиазепоксид (7-хлор-2-метиламино-5-фенил-ЗН-1,4-бензодиазепин-4-оксид) быстро всасывается из желудочно-кишечного тракта. Период полусуществования хлордиазепоксида в плазме крови составляет 22—24 ч. Метаболитами хлордиазепоксида является N-деметилхлордиазепоксид и лактам (7-хлор-1,3-дигидро-5-фенил-2Н-1,4-бензодиазепин-2-он-4-оксид). Часть неизмененного хлордиазепоксида и его метаболитов выделяется с мочой, а часть — образует конъюгаты, которые тоже выделяются с мочой.

Предварительная проба на наличие хлордиазепоксида в крови и моче

От 5 до 10 мл плазмы крови или мочи подщелачивают аммиаком и дважды взбалтывают с хлороформом по 10 мл. Соединенные хлороформные вытяжки взбалтывают с 2 мл воды. Водную фазу отделяют, а хлороформный слой взбалтывают с 5 мл 6 н. раствора соляной кислоты в течение 5 мин. Водные солянокислые вытяжки отделяют от хлороформа, нагревают на водяной бане, а затем эти вытяжки нагревают при 125 °С на парафиновой бане в течение 30 мин (при этом образуется 2-амино-5-хлорбензофенон). К охлажденной жидкости прибавляют 0,5 мл 10 %-го раствора нитрита натрия и оставляют на 3 мин. По истечении указанного времени прибавляют 0,5 мл 0,5 %-го раствора сульфамината аммония и оставляют на 3 мин. Затем прибавляют 0,5 мл 0,1 %-го раствора N-1-нафтилэтилендиамина дигидрохлорида. При наличии хлордиазепоксида в крови или в моче появляется вишнево-красная окраска. Эту реакцию можно использовать для фотоколориметрического определения хлордиазепоксида.

Реакция с нингидрином. Эту реакцию выполняют так, как указано при обнаружении диазепама. При этой реакции хлордиазепоксид дает коричневую окраску.

Реакция с реактивом Марки. Хлордиазепоксид с реактивом Марки дает желтую окраску.

Реакция с реактивом Фреде. С этим реактивом хлордиазепоксид дает оранжевую окраску.

Реакция Витали — Морена. Хлордиазепоксид при реакции Витали — Морена дает желтую окраску.

Обнаружение хлордиазепоксида методом хроматографии в тонком слое сорбента. Обнаружение хлордиазепоксида с помощью этого метода производится так, как и обнаружение диазепама (см. гл. V, § 58).

Обнаружение хлордиазепоксида по УФ- и ИК-спектрам. Хлордиазепоксид в 0,1 н. растворе гидроксида натрия имеет максимумы поглощения при 243 и 260 нм; в 0,1 н. растворе серной кислоты хлордиазепоксид имеет максимумы поглощения при 245 и 306 нм.

Хлордиазепоксид в 0,1 н. растворе соляной кислоты имеет максимумы поглощения при 246 и 308 нм. В ИК-области спектра основание хлордиазепоксида (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1625, 1458 и 760 см ^-1.