1. Методы изолирования:

рК некоторых соединений указаны в Приложении 1.

1.1. Метод №1. Выделение токсикологически важных веществ, основанное на изолировании водой, подкисленной щавелевой кислотой (метод Васильевой).

Объекты: средние навески измельченных желудка (тонкого кишечника) и печени (почки).

Количество объектов: 70-100г; в исключительных случаях при недостаточном количестве биоматериала – 50г.

Объемы извлечений: 50мл кислого эфирного извлечения при рН=2; 50мл щелочного хлороформного извлечения при рН=10.

Реактивы для создания рН среды: рН=2 – 10% раствор щавелевой кислоты; рН=10 – 25% раствор гидроксида аммония.

1.2. Метод №2. Выделение алкалоидов группы опия методом кислотного гидролиза Объекты: средние навески биологических объектов (при наличии мочи - исследуется моча вместо почки).

Количество объектов: органы - 25г; моча, желчь – не менее 10мл.

Объемы извлечений: 25 или 50мл кислого эфирного извлечения при рН=2; 25 или 50мл щелочного хлороформ-этанольного (2:1) или хлороформ-бутанольного 9-1 извлечения при рН=9. (что-то одно)

Реактивы для создания рН среды: рН=7 - 25% раствор гидроксида аммония; рН=9 –насыщенный раствор гидрокарбоната натрия.

1.3. Метод №3. Выделение производных 1,4-бензодиазепина методом кислотного гидролиза.

Объекты: средние навески измельченных биологических объектов; при наличии мочи - берется моча вместо почки.

Количество объектов: органы - 25г; моча – не менее 10мл.

Объемы извлечений: 25 или 50мл щелочного хлороформного извлечения при рН=8.

Реактивы для создания рН среды: рН=9 – 30% раствор гидроксида натрия.

1.4. Метод №4. Выделение производных фенотиазина и др., основанное на изолировании спиртом, подкисленным щавелевой кислотой (метод Стаса-Отто). Может использоваться изолирование ацетонитрилом или ацетоном.

Объекты: средняя навеска биологических объектов.

Количество объектов: 50г.

Объемы извлечений: 50мл кислого эфирного извлечения при рН=2; 50мл щелочного эфирного извлечения при рН=13.

Реактивы для создания рН среды: рН=2 – насыщенный этанольный раствор щавелевой кислоты; рН=13 – 30% раствор гидроксида натрия.

10г органа измельчали (если нужно то 25 или 50г при этом все пропорционально увеличить) и заливали 20, 10 и 10 мл ацетона на 30, 15 и 15 минут соответственно при перемешивании. Ацетоновые вытяжки объединяли, фильтровали и смешивали со 100 мл 2,5% раствора сульфата натрия. Доводили 10% раствором соляной кислоты до рН 1-2 и дважды по 50 мл экстрагировали диэтиловым эфиром. Эфирные извлечения после очистки можно исследовать на вещества кислого характера. Доводили 25% раствором аммиака до рН 10 и дважды экстрагировали хлороформом по 30 мл. Хлороформные извлечения объединяли, пропускали через безводный сульфат натрия, переносили в выпарительную чашку и выпаривали в токе теплого воздуха.

2. Проведение тсх-скрининга :

2.1. Хроматографические пластины:

• с нанесенным слоем силикагеля MERCK 60 F₂₅₄;

• заводские пластины «Сорбфил», «Силуфол», «MERCK»;

- пластины «Сорбфил» и «Силуфол» перед использованием хроматографируются в системе с ацетоном и высушиваются в токе горячего воздуха.

2.2. Приготовление и хранение пластин с нанесенным слоем силикагеля:

• на чистую стеклянную пластину 10x12см, дважды обработанную спирто-эфирной составом (1:1), наносится смесь силикагель MERCK 60 F₂₅₄ – медицинский гипс – дистиллированная вода (2,9г – 0,25г – 11мл);

• время высыхания пластины при комнатной температуре – 15 часов;

• время активирования при 120⁰С – 1 час;

• хранение в эксикаторе над хлоридом кальция в течение 1 недели.

2.3. Приготовление и использование хроматографических систем:

• стеклянные камеры с притертыми или завинчивающимися крышками;

• объем подвижной жидкой фазы (ПЖФ) вносить в камеру из расчета погружения пластины в жидкость на глубину не более 0,5см;

• время встряхивания смешивающихся органических растворителей, входящих в состав ПЖФ – 30сек; плохо смешивающихся органических и водных фаз – 15мин;

• при приготовлении системы бензол-диоксан-25% раствор аммиака (60:35:5), после встряхивания растворителей водную фазу отделить в делительной воронке, а органическую – отфильтровать через небольшое количество безводного сульфата натрия в хроматографическую камеру;

• ПЖФ добавлять в камеру за 30мин до погружения хроматографической пластины или использовать для насыщения камеры фильтровальную бумагу размером с пластинку;

• использование ПЖФ производить однократно.

2.4. Образцы сравнения:

• все образцы сравнения рекомендуется использовать в виде спиртовых растворов 5мг/мл или сухого вещества, находящегося в лунках стрипов или бумажных дисках (перенос веществ на пластину при помощи этанола или метанола);

• количество образца сравнения на пластинах с нанесенным слоем силикагеля – 20-40мкг; на заводских пластинах – 5-30мкг;

• диаметр пятна не более 3-5мм;

• расстояние между пятнами – 1,2-1,5см.

2.5. Количество исследуемого объекта:

- для пластин с нанесенным слоем силикагеля - эквивалент 4-5г органа (диаметр пятна – 5-6мм);

- для заводских пластин - эквивалент 2-3г органа (диаметр пятна – 4-5мм);

- длина полосы исследуемого образца эквивалентного 10-20г органа – около 1,5-2,0см.

2.6. Схема ТСХ-скрининга (см. Табл.1).