6.3.4.2. Системы транспорта кальция

Содержание кальция в отдельных структурах клетки регулируется с участи­ем Са²⁺-помп и Са²⁺-каналов (рис. 6.54).

Рис. 6.54. Основные системы транспорта Са²⁺ в мембранах растительных клеток. Слева представлены Са²⁺-помпы (по Evans, Williams, 1998; Geisler et al., 2000; Hirschi, 2001); справа — Са²⁺-каналы (по Fox, Guerinot, 1998; Sanders et al., 1999; White, 1998, 2000; Blatt, 2000):

ПМ — плазмалемма; В — вакуоль; ВМ — вакуолярная мембрана; ЭР — эндоплазматический ретикулум; АП — антипортер; кан — канал; VD (voltage-dependent) — потенциалзависимый (потенциалуправляемый); Рец — рецептор;

G-бел — регуляторные G-белки плазмалеммы, со­стоящие из субъединиц α, β, γ; ФЛ «С» — фосфолипаза «С»; ФИФ₂ — фосфоинозитол-4,5-бисфосфат; ИФ₃ — инозитол-(1,4,5)-фосфат; цАДФРиб — циклическая АДФ-рибоза; (+) — активация соответствующими лигандами. Са²⁺-помпы: Са²⁺ АТФазы Р-типа (ПМ1, ПМ2 и ПМЗ) и ЭР-типа; антипортер — Са²⁺/Н⁺-АП. Потенциалзависимые (кальциевые каналы) (VD Са²⁺-кан): на ПМ: макси «Кат»-кан — неспецифичный макси-катионный канал; VD Са²⁺-кан — Са²⁺-специфичный; УБ-мехСа²⁺-кан — механочувствительный канал (активируется гиперполяризаци­ей); на вакуолярной мембране: BVD Са²⁺-кан — потенциалуправляемый (активируется гиперполя­ризацией), SVD Са²⁺-кан — медленно (slowly) активируемый деполяризацией; на мембране ЭР локализован 3PVD

Са²⁺-кан. Лигандо-управляемые кальциевые каналы: на ВМ: ИФ₃-активируемый ВИФ₃ Са²⁺-кан; цАДФРиб-активируемый, предположительно имеющий рецептор рианодина цАДФРиб Са²⁺-кан; на ЭРМ: рецептор-управляемый канал — ИФ₃Са²⁺-кан (более подроб­ную характеристику см. в тексте)

Градиент электрохимического потен­циала для Са²⁺ на плазмалемме (ПМ), тонопласте (ВМ) и мембране ЭР таков, что поступление Са²⁺ в цитозоль происходит по каналам пассивно, а удаление с участием помп — с затратой энергии.

Низкая концентрация кальция в цитозоле — необходимое условие для функ­ционирования Са²⁺ в качестве универсального посредника при передаче инфор­мации. Реализация функций мессенджера связана с очень малыми его потоками через мембраны. Разнообразные стимулы (гормоны, свет, механические воздей­ствия, гипоосмотики и окислители, засуха, низкая и высокая температура, Nod-фактор, сигналы межклеточных взаимодействий, гравиотропизм и др.) через быстрое изменение потенциала клеточной мембраны приводят к открыванию Са²⁺-каналов и возрастанию его концентрации в цитозоле. Возвращение кон­центрации Са²⁺ к стационарному уровню покоя обеспечивается работой Са²⁺-АТФаз. Такое изменение концентрации Са²⁺ в цитозоле названо нестационар­ным, или переходным (transient), состоянием. Локальное и часто кратковре­менное увеличение концентрации Са²⁺ в цитозоле действует как сигнал, передающий информацию от поверхности клетки внутрь. Кальциевый сигнал может усиливаться за счет дополнительного выхода Са в цитозоль из вакуоли или ЭР.

Са ⁺-помпы. Выкачивание Са из цитозоля осуществляют Са -АТФазы, которые принадлежат к большому семейству АТФаз Р-типа, и Са /Н -антипортеры.

Са²⁺-АТФазы растений и животных подразделяют на помпы: ПМ (или ПВ)-типа, стимулируемые кальмодулином (КаМ), и ЭР (или ПА)-типа, которые непосредственно КаМ не стимулируются. У растений в отличие от животных Са -АТФазы ПМ-типа локализованы не только на плазмалемме (Са -АТФаза ПМ1), но и на эндомембранах (Са²⁺-АТФаза ПМ2 и ПМЗ) (рис. 6.54). Са²⁺-АТФазы ЭР-типа также присутствуют как на мембране ЭР, так и на тонопласте. На тонопласте, помимо

Са -помпы, функционирует Са /Н -антипортер. Выкачивание Са из цитозоля с участием антипортера сопряжено с работой вакуолярной Н⁺-АТФазы, для которой гомеостатирование кальция считается конститутивной функцией. Более того, вакуолярная Н⁺-АТФаза, пирофосфа-таза (Н⁺-ПФаза) и Са²⁺/Н⁺-антипортер совместно участвуют в поддержании рН и ионного гомеостаза в цитозольном и вакуолярном компартментах. Неко­торые Са²⁺-АТФазы и

Са²⁺/Н⁺-антипортеры идентифицированы на генном уровне.

Итак, Са -помпы выполняют несколько важных функций. Наряду с цент­ральной — поддержание низкой концентрации кальция и создание фона для возникновения кальциевого сигнала — они обеспечивают создание пулов Са в апопласте, вакуоли, ЭР, откуда он может контролируемо возвращаться в цитозоль. Функционирование Са -АТФаз, связанное с восстановлением [Са ]_цит до уровня покоя, одновременно обеспечивает завершение переходного состо­яния и, таким образом, формирование Са -сигнала (см. подразд. 6.3.4.3).

Са -каналы. Кальциевые каналы подразделяют на две группы: потенциал-зависимые (VD — voltage-dependent) и рецепторуправляемые, или лигандозависимые. К настоящему времени изучены электрические и биохимические свой­ства, регуляция и физиологическая роль ряда кальциевых каналов из разных мембран растений, но пока не осуществлена их идентификация на генетиче­ском уровне.

В плазмалемме клеток, главным образом корней и замыкающих клеток ус­тьица, обнаружено несколько VD Са²⁺-каналов, которые могут быть подразде­лены на каналы, активируемые при деполяризации и при гиперполяризации плазмалеммы. К первому классу относится так называемый «макси-катионный канал» (рис. 6.54), который имеет высокую проводимость единичного канала, но малоселективен. Он пропускает К⁺, Na⁺, Ba , Mg , Мn и некоторые дру­гие ионы, хотя вход Са через этот канал при физиологических концентрациях ионов, видимо, доминирует. Другой Са -канал, также активируемый при деполяризации

(VD Са -канал), более селективен для Са , но имеет мень­шую проводимость. Неселективные каналы, очевидно, служат основными во­ротами поступления кальция в клетку из внешней среды, например в кор­нях, или из апопласта в устьичные клетки листа. В класс VD Са -каналов плазмалеммы, активируемых при гиперполяризации, входят механочувствительные (stretch-activated) каналы разных типов, в том числе и Са²⁺-канал замыкающих клеток устьица, который регулируется АБК, — VD-мех Са²⁺-канал (рис. 6.54). У других клеток подобные каналы также могут иметь большое значение в восприятии тургора, например при удлинении корневого волоска и пыльцевой трубки.

На тонопласте функционируют потенциалзависимые каналы, активирую­щиеся при гиперполяризации — BVD Са²⁺-канал и при деполяризации — мед­ленный (slowly) SVD Са²⁺-канал (рис. 6.54). Оба типа VD-каналов не являются строго специфичными для Са²⁺ и проницаемы также для Mg²⁺, K⁺; SVD Са²⁺-канал проницаем также и для Na⁺, Rb⁺, Cs⁺. Выход Са²⁺ через SVD

Са²⁺-канал активируется, помимо потенциала, при увеличении [Са ⁺]_цит и регули­руется другими факторами (рН, концентрацией других ионов, соотношением [Са ⁺]_цит/[Са ⁺]_вак, КаМ,

14-3-3-белками и, возможно, состоянием фосфорилированное-дефосфорилированное). Функции SVD Са²⁺-канала связывают с осморегуляцией и поддержанием гомеостаза. Кроме того, через этот канал про­исходит Са²⁺-индуцируемое высвобождение Са²⁺ из вакуоли (CICR — Са²⁺ induced Ca²⁺ release), что приводит к увеличению его концентрации в цитозоле и вносит вклад в специфичность сигнала (см. подразд. 6.3.4.3).

Из вакуоли Са выходит также через рецепторуправляемые каналы, которые открываются при рецепции вторичных мессенджеров: инозитол-1,4,5-фосфата (ИФ₃ — инозитолтрифосфат) или циклической АДФ-рибозы (цАДФриб) (рис. 6.54). С активацией этих вакуолярных каналов связаны ответные реакции на гиперосмотический (ВИФ₃ Са²⁺-кан) и холодовой (цАДФриб

Са²⁺-кан) шок. В ответ на действие АБК при закрывании устьиц активируются оба эти канала. В мембране ЭР также присутствуют потенциал- и лигандозависимые Са -каналы. Одним из первых каналов ЭР мембраны растений был охарактеризован потенциалзависимый механочувствительный канал (3FVD Са²⁺-кан) (рис. 6.54) из усиков переступня двудомного (Bryonia dioica) (назван ВСС1 — Bryonia calcium channal). Предполагают, что ВСС1 регулируется через изменение концентрации кальция в люмене ЭР, хотя рН цитозоля также влияет на его активность. С ИФ₃ Са²⁺-каналом ЭР мембраны связывают увеличение [Са²⁺]_цит и передачу инфор­мации в растущей пыльцевой трубке.

Итак, в растительной клетке в ответ на действие разных стимулов увеличи­вается концентрация кальция в цитозоле, что является Са²⁺-сигналом для пе­редачи информации. Первичными источниками изменений концентрации яв­ляются Са -каналы с разными пропускными характеристиками, разными спо­собами регуляции и расположенные на плазмалемме и эндомембранах. Разно­образие путей входа Са²⁺ в цитозоль вместе с разнообразием путей выхода (Са²⁺-помпы) создают большую гибкость в контроле за его потоками как в пространстве клетки, так и во времени, и обеспечивают возникновение спе­цифического Са²⁺-сигнала, локализованного в связи с участием каналов раз­ных типов в определенных участках клетки.

6.3.4.3. Са²⁺ и системы внутриклеточной сигнализации

Изменение программ роста и развития, контроль метаболизма и формиро­вание ответных реакций на действие условий среды происходят вследствие передачи сигналов на белки-мишени или в геном по сложной сети информа­ционных (сигнальных) путей. В клетке информация передается цитозольным структурам и компартментам через изменения концентраций множества вто­ричных мессенджеров (посредников), которые действуют в той или иной сиг­нальной системе вместе с кальцием или самостоятельно. Однако Са в комп­лексной сети передачи информации (transduction) служит универсальным по­средником, поскольку ни один вторичный мессенджер не реагирует на столь большое число стимулов, как свободный Са цитозоля. Включение Са в широкую сеть сигнальных путей, которые передают послания от разных стимулов (внешних и внутренних) и заканчиваются соответствующими ответны­ми реакциями, поднимает вопрос о том, каким образом в растительной клет­ке с участием одного и того же мессенджера достигается специфичность со­пряжения стимула и ответа.

Специфичность Са -сигнала. Исходно в основе специфичности кальциевой сигнализации лежит компетентность клетки, ее функциональное предназна­чение. Способность реагировать на определенные стимулы и формировать со­ответствующий ответ зависит от экспрессии генов, кодирующих компоненты каскадного пути передачи конкретного сигнала в соответствующих клетках. Комплекс характерных свойств клетки, определяющий особенность ее сиг­нальной системы, получил название «физиологического адреса», который раз­личается у разных клеток (например, у замыкающих клеток устьиц и трихобластов корня). Информация от стимулов, включая силу их воздействия, пер­воначально кодируется в кальциевом сигнале, отражающем характер возраста­ния концентрации Са²⁺ в цитозоле ([Са²⁺])_цит. Это переходное (транзитное) со­стояние может иметь вид всплесков, волн, пульсаций или осцилляции, плато, градиента или быть сочетанием этих проявлений (рис. 6.55). Основные варьиру­ющие параметры Са²⁺-сигнала, которые могут быть оценены количественно, это: уровень увеличения [Са²⁺]_цит; продолжительность лаг-периода от момента воздействия до начала подъема [Са ]; продолжительность подъема, нахожде­ния на высоком уровне и возвращения к уровню покоя. Сигнальная информа­ция может быть закодирована в амплитуде и частоте осцилляции (пульсаций), а также их регулярности.

Рис. 6.55. Особенности переходного состояния [Са²⁺]_цит в зависимости от стимулов (по данным: 1 — Malho et al., 1998; Plieth et al, 1999; 2 — Malho et al, 1998; Cessna et al., 1998; 3 — Malho et al., 1998; Legue et al., 1997; 4 - Grabov, Blatt, 1998; Staxen et al., 1999; Blatt, 2000; Hamilton et al., 2000; 5 - Bibikova et al., 1997; Wymer, Bibikova, 1997;

6 — Cardenas et al., 1999, 2000).

Время в секундах (с) или минутах (мин) указывает на продолжительность: подъема—высокого уровня—спада [Са²⁺]_цит; стрелкой отмечен момент воздействия

плазмалеммы, в результате этого диссоциирует их α-субъединица, активирую­щая фосфолипазу С (ФЛ «С»)*. Активированная ФЛ «С» гидролизует ФИФ₂ с

* Активированные G-белки передают сигнал и другим фосфолипазам плазмалеммы, а также циклазам и каналам, которые в свою очередь участвуют в образовании вторичных мессенджеров.

Даже самое общее сравнение характера Са -сигналов при действии разных стимулов (рис. 6.55) свидетельствует об их разнообразии: кратковременное (холодовой шок) или очень продолжительное (красный свет) увеличение [Са ]_цит; появление двухфазной кинетики переходного состояния (гипоосмотический шок) или образование градиента концентрации Са (рас­тущий корневой волосок). Кинетика изменения концентрации Са²⁺ может ме­няться в зависимости от силы и продолжительности действия стимула. Однако только в редких случаях величина изменения [Са²⁺]_цит и конечная ответная реакция на стимул коррелируют со степенью его воздействия. Это обусловлено множеством причин, в частности тем, что стимул (фактор) в своем действую­щем начале имеет две составляющие: само воздействие (физическое, химиче­ское или комплексное) и параметры времени. При холодовом шоке, например, увеличение уровня [Са ]_цит (которое начинается сразу) (рис. 6.55, 1) зависит не от абсолютного значения низкой температуры, а от скорости ее снижения. При действии многих стимулов увеличение [Са²⁺] в Цитоплазме связано с осцилляциями (пульсациями), которые имеют определенную амплитуду и час­тоту и могут повторяться через менее или более регулярные интервалы (рис. 6.55, 4, 6). Характер осцилляции также определяет специфику Са -сигнала.

Разнообразие свойств и способов регуляции Са -каналов является осно­вой, обеспечивающей взаимодействие путей передачи сигналов с участием разных посредников. Идентифицирован ряд вторичных мессенджеров, которые связаны с возникновением и спецификой Са -сигнала (ИФ₃, цАДФриб, Н⁺ и др.). Инозитол-1,4,5,-фосфат — конечный продукт превращения минорного компонента плазмалеммы фосфатидилинозитола (ФИ), но непосредственным предшественником ИФ₃ является ФИФ₂ (ФИ-4,5-бисфосфат) (см. рис. 6.54). При рецепции определенных стимулов активируются регуляторные G-белки образованием двух вторичных мессенджеров:

1,2-диацетилглицерола (ДАТ*) — активатора протеинкиназы С и ИФ₃ — регулятора активности Са²⁺-каналов эндомембран (его считают основным участником формирования Са²⁺-волны). Другой распространенный вторичный мессенджер животных и растительных клеток — цАДФриб также действует как сигнальная молекула, активирующая выход Са из эндогенных депо.

Поступление кальция в цитозоль через рецепторуправляемые Са -каналы эндомембран вносит дополнительный (к притоку Са²⁺ извне) вклад в увеличе­ние [Са ]_цит и приводит к возникновению и поддержанию осцилляции (на­пример, в базальной части растущей пыльцевой трубки, при осмотическом стрессе, при действии АБК в замыкающих клетках устьица) (рис. 6.55, 4). Та­ким способом сигнальная информация не только кодируется по амплитуде и частоте всплесков, но с помощью осцилляции сигнал усиливается и меняется по продолжительности, что обеспечивает регуляцию его передачи во времени.

Специфичность Са²⁺-сигнала обусловлена также его локализацией в клетке и, если это касается такой формы сигнала как градиент или волна, — векто­ром их распространения. Разный характер увеличения концентрации Са²⁺ в цитозоле может быть результатом его поступления из разных депо (апопласт, вакуоль, ЭР) через разнообразные Са²⁺-каналы, а снижение [Са²⁺]_цит при воз­вращении к уровню покоя (новый уровень может не совпадать с исходным) за счет работы

Са²⁺-АТФаз разных мембран (см. рис. 6.54). В клетках, растущих кончиком (трихобласт, пыльцевая трубка и др.), сигналом ориентированного роста служит градиент с высокой концентрацией Са²⁺ в растущем кончике (см. рис. 6.55, 5). Основой поддержания этого градиента является простран­ственное разделение входа Са²⁺ в цитозоль по Са²⁺-каналам плазмалеммы в зоне активного роста кончика и выкачивания Са²⁺-АТФазами плазмалеммы и эндомембран в базальной части клетки корневого волоска. При воздействии Nod-фактора, вызывающего образование азотфиксирующих клубеньков у бо­бовых, кальций также поступает извне через Са²⁺-каналы кончика корневого волоска (см. рис. 6.55, 6). Но Са²⁺-сигнал проявляется как быстро нарастающее увеличение [Са²⁺]_шт и всплески в области ядра, что приводит к скручиванию корневого волоска и смене программ дифференциации и функционирования.

Образование всплесков, осцилляции, волн, градиентов концентрации Са цитозоля, их разнообразных субпроизводных и сочетаний, а также различия в динамике и локализации изменений [Са ]_цит отражают комплексность систе­мы формирования Са -сигнала в каждой отдельной клетке. Возникающий в ответ на определенный стимул Са -сигнал настолько специфично кодирует информацию, что получил название Са²⁺-подписи (Са²⁺ signature). Подобный специфичный Са²⁺-сигнал — первый этап возникновения специфичной ответ­ной реакции.

Пути передачи Са²⁺-сигнала. Зашифрованная информация для достижения нужных белков-мишеней, определяющих ответ на стимул, передается по сиг­нальным путям благодаря образованию комплексов кальция со специальными белками. К группе регуляторных белков растений, связывающих Са , относятся: кальмодулин — КаМ (СаМ — calmodulin); Са²⁺-зависимые протеинкиназы — Са²⁺-завПК (CDPKs — calcium dependent protein kinases) и Са²⁺/КаМ-зависимые протеинкиназы — Са²⁺/КаМ ПК (CCaMKs — calcium and calmodulin dependent protein kinases) (рис. 6.56). Эти белки имеют специальные места связывания Са²⁺, называемые EF-руками. Термин возник из обозначения двух α-спиралей, Е и F, являющихся частью Са²⁺-связывающего центра. Часто бел­ки, имеющие подобные домены связывания кальция, называют, как группу регуляторных белков, «EF-рука».

* ДАГ и продукты активации ФЛ «С» и «А», вероятно, остаются в плазмалемме, где могут добавочно модифицировать функции мембранных белков. ФИФ₂ и другие фосфолипиды могут не­посредственно связываться с компонентами цитоскелета, изменяя их конформацию и функции.

Са -завПКзы принадлежат к одной из групп суперсемейства протеинкиназ (ПК) эукариотических клеток. ПКазы катализируют обратимый перенос фос­фата с АТФ на боковые участки аминокислот белковой цепи. Функции ПК могут быть обращены действием протеиновых фосфатаз (ПФФ). Реакции фосфорилирования-дефосфорилирования оказывают значительное воздействие на активность белков и их взаимодействие с другими белками. Са²⁺-завПКазы имеют три функциональных домена — каталитический, автоингибиторный и С-терминальный кальмодулинподобный регуляторный домен с четырьмя EF-рука­ми, связывающими Са . Это позволяет считать Са²⁺-завПКазы (как и КаМ) первичными сенсорами путей передачи Са²⁺-сигнала (рис. 6.56, 4а, 46). Впер­вые Са²⁺-завПКзы были обнаружены у растений и простейших и пока не най­дены в клетках дрожжей и животных. Считают, что у растений большая часть киназной активности, которая стимулируется кальцием, связана именно с Са ⁺-завПКазами (меньшая — с Са /КаМ ПКазами и КаМ). Обнаружено множество изоформ Са ⁺-завПКаз (у Arabidopsis идентифицировано более 40 изоформ). Это ставит вопрос о функциях этих изоформ. Есть основание полагать, что разные изоформы могут «специализироваться» на узнавании

Са²⁺-сигналов. Постоян­но пополняемый список белков-мишеней для Са²⁺-завПК включает транспорт­ные белки мембран (Н⁺АТФазу ПМ, калиевые и анионные каналы замыкаю­щих клеток устьиц, аквапорины и др.), ферменты (сахарофосфатсинтазу (СФС), фосфоенолпируваткарбоксилазу (ФЕПК), нитратредуктазу (HP), фосфатидилинозитолкиназу и др.), факторы транскрипции, элонгации, белки цитоскелета и другие мишени (рис. 6.56, 5). Таким образом, Са²⁺-завПК включены в передачу Са²⁺-сигнала, связанную с поддержанием мембранного потенциала, регуляцией углеводного и азотного обмена, устьичными движениями, ответа­ми на стрессовые воздействия, формированием архитектуры клетки и т.д.

Однако, по-видимому, полная активация фермента при фосфорилировании с участием

Са²⁺-завПКаз возможна, если к регуляторному участку одно­временно присоединяется

14-3-3-белок. Оба компонента включены в передачу сигнала и функционируют как адаптеры, шапероны, активаторы и репрессоры. Они участвуют в регуляции активности СФС, HP, ФЕПК, что обеспечива­ет согласованное функционирование этих ферментов в условиях дня и ночи.

14-3-3-белкам приписывается также роль обеспечения взаимосвязи между раз­личными путями передачи сигналов, которые вызываются разными, действу­ющими одновременно стимулами (экзогенными и эндогенными).

Кальмодулин (КаМ) относится к семейству белков «EF-рука» и является наиболее распространенным Са -связывающим белком, который играет цен­тральную роль у всех организмов. Растительные КаМ — высококислые белки с молекулярной массой 14 кДа, локализованные в цитозоле (обнаружены в ядре и, возможно, прикреплены к плазмалемме). КаМ эукариотных организмов обладает большой консервативностью: аминокислотные последовательности белка растений идентичны КаМ позвоночных и дрожжей на 90 и 60 % соответ­ственно. Но у растений, в отличие от животных, обнаружены мультигенные семейства КаМ-родственных генов, экспрессия которых индуцируется физи­ческими (касание, тепловой и холодовой шок, темнота-свет) и химическими (ауксин, NaCl) стимулами. Индуцированная экспрессия некоторых из этих КаМ-генов опосредована увеличением [Са²⁺]_цит (рис, 6.56, 4в). Предполагает­ся, что характер их экспрессии, заканчивающийся появлением изоформ КаМ (рис. 6.56, 6), и/или конечные мишени сигнального пути (рис. 6.56, 5, 5а, 5в)

Рис. 6.56. Общая схема путей передачи Са²⁺-сигнала на мишени и ответная реакция

растительной клетки на разные стимулы (Н.Д.Алехина, 2004):

Рец — рецепторы на плазмалемме и эндомембранах; [Са ] — концентрация Са ; КаМ и Са²⁺-КаМ — кальмодулин и его комплекс с Са²⁺; Са²⁺-завПК и ПФФ — Са -зависимые протеинкиназы и протеинфосфатазы; Са²⁺/КаМ ПК, ПФФ — кальций и кальмодулинзависимая протеинкиназа, ПФФ; (+++) — деполяризация мембран; 1—6 — последовательность событий при восприятии стимула, возникновении Са²⁺-сигнала и путей его передачи (downstream transduction): 1 — рецепция различных абиотических (свет, холод, температура, гипоксия, засуха, ветер, механические воздействия и др.) и биотических (фитогормоны, патогены, симбионты и др.) стимулов, изменение мембранного потенциала (+ + +) и активация Са -каналов; 2 — инфлакс ^г Са²⁺ через каналы в цитозоль из внешней среды и внутриклеточных депо и кратковременное увеличение [Са²⁺]_цит; 3 — выкачивание Са²⁺ благодаря работе Са²⁺-помп, окончание переходного состояния [Са²⁺]_цит; 4 — связывание Са²⁺ с первичными сенсорами (4а — Са -завПКазами и ПФФазами; 46 — образование комплекса Са²⁺-КаМ; 4в — индукция синтеза КаМ); 5— активация белков-мишеней: 5а, 56 — при каскадной передаче через активацию Са /КяМ ПК. или ПФФ; 5в — регуляция экспрессии генов через

Са²⁺-КаМ-комплекс или с участием Са /КаМ ПФФ; 6 — общие ответные реакции на стимул (быстрые или более медленные, если включается геном)

различаются в зависимости от стимула. Таким образом, наличие изоформ КаМ значительно расширяет возможности адресной доставки сигнала. КаМ и комп­лекс Са²⁺-КаМ не обладают свойствами фермента и включаются в передачу сигнала и регуляцию клеточных процессов, присоединяясь к белкам-мишеням. Связывающий кальций центр КаМ имеет структуру спираль — петля — спираль. Петля, где связывается Са²⁺, состоит из 12 аминокислот и ограничена с С- и

N-концов α-спиральными участками, состоящими также из 12-14 аминокис­лот и обозначенными буквами Е и F. Разные Са²⁺-связывающие белки могут иметь разное число центров для связывания Са²⁺. Кальмодулины растений имеют четыре функциональные «EF-руки» с Са²⁺-связывающими доменами. Связы­вание Са при увеличении его концентрации в цитоплазме вызывает про­странственную переориентацию аминокислот в петле и α-спиралях и пере­упаковку этих центров, связывающих Са²⁺, в структуре всего КаМ-белка. Пе­редача сигнала становится возможной, если эти конформационные перестрой­ки «узнаются» белками-мишенями, которые, в конечном итоге, преобразуют изменения концентрации Са²⁺ в цитозоле в ответ на специфический сигнал (рис. 6.56, 5).

Концентрация КаМ в цитозоле может составлять 5 — 20 мкМ и варьирует в разных типах клеток. Это предполагает вероятность конкуренции за КаМ меж­ду КаМ-связывающими белками, что может играть роль в детерминировании клеточного ответа на увеличение [Са²⁺]_цит. Взаимодействие между Са -КаМ и КаМ-регулируемыми белками главным образом гидрофобное, и даже незна­чительные модификации последовательностей на гидрофобном прикрепля­ющем участке КаМ могут лишить его возможности активировать белки-ми­шени.

Важное отличительное свойство Са -КаМ-комплекса — способность свя­зываться с большим числом разнообразных белков-мишеней. Са -КаМ-комплекс активирует непосредственно или через модификацию реакций фосфорилирования-дефосфорилирования много больше 100 белков. У животных иден­тифицировано более 30 ферментов и других белков, которые регулируются

Са -КаМ. В растительной клетке таких белков идентифицировано охаракте­ризовано значительно меньше. Са -КаМ-зависимыми являются: Са -АТФазы

II В-типа; SV — вакуолярный катионный канал; НАД-киназа, глутаматдекарбоксилаза, супероксиддисмутаза; миозин V, киназин; ПКазы и ПФФаза 2В, белки кончика корня и некоторые другие (см. рис. 6.56, 5, 5а).

Мишенями, на которые передаются Са -сигналы, часто являются транс­портные системы, в том числе Са²⁺-помпы. Са²⁺-АТФазы II В-типа обеспечи­вают регуляцию [Са ]_цит, необходимую для возникновения Са²⁺-сигнала, оп­ределяют характер переходного состояния, связанный с завершающей стади­ей, и в то же время сама их активность регулируется с участием Са²⁺-КаМ. Са²⁺-АТФазы II В-типа являются компонентами не только плазмалеммы, но и эндомембран (см. рис. 6.54), и, возможно, локализованы в оболочке ядра. КаМ регулирует активность Са²⁺-помпы, связываясь на автоингибиторном домене С-конца, что меняет пространственное расположение этого участка и снимает его блокирующее действие. У растительных Са²⁺-АТФаз (по крайней мере у не­которых: АСА2 — Arabidopsis Са²⁺-АТФазы, локализованной на мембране ЭР, и SCA1 — soybean Са²⁺-АТФазы, локализованной на ПМ) КаМ-связывающий домен находится не на С-конце, а на N-терминале. У растений, как и у живот­ных, КаМ-зависимые Са²⁺-АТФазы эндоплазматического ретикулума могут быть ведущими в регуляции и поддержании осцилляции и волны [Са²⁺]_цит.

Комплекс Са²⁺-КаМ может включаться в каскадную передачу Са²⁺-сигнала, взаимодействуя с киназами, относящимися к группе кальций/кальмодулинзависимых протеинкиназ (Са²⁺/КаМ ПК) (см. рис. 6.56, 5а). Эти ПК имеют не четыре, как Са²⁺-завПК и КаМ, а три «EF-руки» на регуляторном домене. Са²⁺-КаМ связывается на сайте автоингибиторного домена, вследствие чего, как предполагают, происходит активирование Са²⁺/КаМ-протеинкиназы, которые могут выполнять специальные функции в каскадной передаче сигнала. Это обус­ловлено их субстратной специфичностью, субклеточной локализацией и чув­ствительностью к кальцию, которые не совпадают с подобными характерис­тиками у Са -завПК. Параллельно с митогенактивируемыми протеинкиназами (МАПК) Са /КаМ-протеинкиназы регулируют экспрессию гена, фосфо-рилируя фактор транскрипции при получении Са -сигнала (см. рис. 6.56, 5в). Действие протеинкиназ может быть нейтрализовано или обращено протеинфосфатазами. По существу, именно баланс фосфорилирования—дефосфорилирования белков регулирует многочисленные реакции и процессы в клетке и включен в систему передачи сигналов. ПФФазы (как и ПКазы) подразделя­ют на две большие группы по субстратной специфичности аминокислот

(серин/треонин либо тирозин) в сайте, где связывается и отщепляется фосфат­ная группа. В группу Сер/Тре ПФФ входит четыре семейства, среди которых ПФФазы 2В-типа являются

Са²⁺-КаМ-зависимыми. Сведений о ПФФазах зна­чительно меньше, чем о ПКазах. Установлено, что они не только выполняют функции контрагентов киназ, но также играют ведущую роль во многих сиг­нальных каскадах: при передаче сигнала от АБК на ионные каналы в замыка­ющих клетках устьиц, при стрессовых ответах на патогены, при регуляции роста корневого волоска, при свето- и гравиотропизмах и т.д.

У животных наиболее изучена Са -КаМ ПФФаза кальцийнейрин (КН). В клетках A. taliana также обнаружена ПФФаза, подобная КН. Она взаимодействует с Са²⁺-КаМ и активируется при возникновении Са²⁺-сигнала. КН — гетеродимер, состоящий из консервативной каталитической субъединицы А-типа (объе­динена с одной из вариабельных субъединиц) и регуляторной субъединицы В-типа (КНВ, где В — буква латинского алфавита). В корнях и стебле арабидопсиса присутствует 6 изоформ КНВ, синтез одной из них активируется при действии засухи, холода, ветра. Наличие изоформ у КНВ и КаМ значительно увеличивает число возможных комбинаций при их совместном регулировании активности белков-мишеней, расширяя спектр специфичности ответов.

Функция КНВ может быть связана с прикреплением фермента к цитоскелету или мембране: это определит место в пространстве, где будет проявляться дефосфорилирующая активность. Предполагают, что КН может являться од­ним из компонентов трансдукона — большого комплекса разнообразных бел­ков плазмалеммы, включенных в каскад стимул-ответ. Например, трансдуксон может служить системой поддержания и регуляции тургора и объединять ре­цепторы, вторичные мессенджеры, К⁺- и Са²⁺- и анионные каналы, Са²⁺-ПКазу и КН, Са -АТФазу и КаМ, если помпа активирована. Подобный трансдукон может быть включен в разнообразные двигательные реакции растений (устьичные движения, тропизмы, настии и т.д.). Возможно, КН — один из компо­нентов механизма контроля ионных потоков из среды в корни.

С реакцией дефосфорилирования связывают еще одну важную функцию — декодирование информации, зашифрованной в виде пиков и осцилляции каль­циевого сигнала. Модель дешифровки этой информации предполагает совмес­тное функционирование ПКаз и ПФФаз, имеющих разную кинетику Са -зависимой активации.

Итак, передача Са²⁺-сигнала на белки-мишени может происходить разны­ми путями с участием первичных сенсоров (Са -ПКазы, КаМ) либо по более длинным каскадным путям (см. рис. 6.56). При этом через КаМ, ПК и ПФФ, имеющих множество изоформ, осуществляются специфическое декодирова­ние Са -сигнала и передача информации к нужному белку-эффектору (мише­ни). Часто белками-мишенями становятся Са -каналы, Са -АТФазы и другие ионные каналы и помпы. Мишенями для сигналов, передаваемых по различным Са -зависимым сигнальным путям, могут быть отдельные ферментные систе­мы, цитоскелетные белки, белки факторов транскрипции и др. (см. рис. 6.56).

Ответные реакции, связанные с Са -сигнализацией, ранее подразделяли на быстрые, происходящие на пост-трансляционном уровне, и медленные, связанные с экспрессией генома. В настоящее время быстрый и медленный ответы рассматриваются как разные стадии одного общего процесса адаптив­ной модификации метаболизма. Связанная с экспрессией генома

Са -сигна­лизация часто сочетается с гормональной регуляцией процессов, это еще больше осложняет расшифровку сети разных путей передачи сигнала в клетке.