6.3.2. Азот

6.3.2.1. Формы азота, используемые растением

В среде обитания растений азот представлен в виде газообразного азота ат­мосферы N₂ (-78 %) и в составе органических и неорганических соединений в почве, пресной и морской воде (см. рис. 6.1). Растениям недоступны напрямую огромный запас азота в воздухе и органический азот почвы, на долю которого приходится 99 % общего азота почвы. Они поглощают азот из почвы в виде минеральных ионов нитрата и аммония.

Азот почвы происходит из атмосферы в результате процессов химической и биологической азотфиксации. Биологическая азотфиксация — уникальная спо­собность некоторых прокариот (цианобактерий, актиномицетов, зеленых сер­ных бактерий, бактерий родов Azotobacter и Clostridium и др.) восстанавливать N₂ до NH4 при обычных температуре и давлении. Органический азот почвы может быть превращен в NH| в процессе аммонификации — разложения орга­нического вещества гетеротрофными бактериями. Пополнение пула нитратно­го азота почвы обеспечивают бактерии нитрификаторы, которые используют для жизнедеятельности энергию окисления аммония до нитрата. Процессы денитрификации, осуществляемые анаэробными микроорганизмами, приводят к потерям почвенного минерального азота и его переходу в атмосферный N₂ (см. рис. 6.1).

Биологическая азотфиксация вносит наиболее значительный вклад в круго­ворот азота в биосфере. Азотфиксирующие организмы можно разделить на две

группы: свободноживущие и симбиотические формы. Существует три основ­ных типа азотфиксирующих симбиозов микроорганизмов с растениями: ризобий с большой группой бобовых растений (Fabaceae), цианобактерий с голо­семенными и актиномицетов с небобовыми покрытосеменными растениями. Бобовые — самая большая группа растений, образующих «товарищество» с бактериями-азотфиксаторами рода Rhizobium. В симбиотические отношения вступают арахис (Arachis hypogaea), маш (Vigna radiatd), соя (Glycine max), че­чевица (Lens culinaris), горох (Pisum sativum), фасоль (Phaseolus vulgaris), лю­церна (Medicago sativa), клевер (Trifolium acer), люпин (Lupinus), бобы (Vicia faba) и другие. Растение-хозяин снабжает бактерии углеводными компонента­ми и получает зафиксированный атмосферный N₂ в виде аминокислот, ами­дов или уреидов.

6.3.2.2. Поглощение и усвоение нитрата

Нитрат считают основным источником минерального азота для растений, хотя для его усвоения необходимо высокое содержание углеводов и большие запасы энергии. На хорошо аэрируемых не очень кислых почвах большая часть минерального азота представлена именно нитратом, который находится в вод­ной фазе. Анион легко перемещается с током воды в почве. Особенно быстро происходит его вымывание из поверхностного слоя, в котором расположены корни растений. В силу высокой подвижности концентрация NO в почвенном растворе изменяется в широких пределах: от 5 мкМ до 2 мМ и выше и во многом зависит от климатических факторов.

Усвоение нитрата — сложно организованная система последовательных биохимических и физиологических процессов, включающая поступление аниона в корень, его восстановление и накопление в корнях, радиальный транспорт, загрузку NO в сосуды ксилемы и транслокацию в надземные органы, восста­новление и накопление нитрата в листьях (рис. 6.37).

Рис 6.37. Общая схема поступления и усвоения нитрата в растении

У некоторых растений доля нитрата, транспортируемого в побег, достигает 80 — 90 %. Из листьев же в корни NO не перемещается. Азот нитрата, восстановленный в корнях, в виде аминокислот, амидов или уреидов поступает в побеги. На уровне целого расте­ния происходит довольнаинтенсивный круговорот аминокислот и амидов между надземными органами и корнями. Содержание N в ксилеме достигает 0,01 — 0,21 % (масса/объем), во флоэме оно в 10 — 20 раз ниже.

Усвоение нитрата генетически детерминировано, что выражается в видо­вой и сортовой специфике поглощения NOJ, распределения по органам, вос­становления и накопления. Накопление нитрата в тканях, достигающее при определенных условиях высоких значений, — одна из особенностей азотного обмена растений. С одной стороны, в условиях возникшего азотного дефицита накопленный ранее NO3 служит эндогенным источником N для новых азот-потребляющих синтезов. С другой стороны, нитрат, местом накопления кото­рого служит вакуоль, выполняет осморегуляторную функцию.

Поглощение нитрата. Механизмы транспорта через плазмалемму. Движущей силой транспорта через плазмалемму является протонный градиент. Это вто­ричный активный транспорт в симпорте с протоном.

Кинетически в растительной клетке идентифицированы две системы транс­порта NO : 1) высокого сродства — HATS (high-affinity transport system), или механизм I, 2) низкого сродства — LATS (low-affinity transport system), или механизм П.

Работа HATS описывается кинетической кривой Михаэлиса—Ментен: ско­рость поглощения нитрата достигает насыщения при концентрациях 0,2 — 0,5 мМ NO ; К_т обычно колеблется в диапазоне от 10 до 100 мкМ. Система транспорта высокого сродства может быть конститутивной, которая индуци­руется в отсутствие нитрата, и индуцибельной, индуцируемой нитратом.

Поглощение нитрата через LATS наблюдается при концентрациях NO выше 0,5 мМ и не достигает насыщения. Считается, что система транспорта нитрата низкого сродства является конститутивной, однако последние работы с мутантными формами Arabidopsis выявили индуцируемую нитратом форму LATS.

Идентифицированы два семейства мембранных белков, которые могут осу­ществлять активный транспорт нитрата через плазмалемму в симпорте с про­тоном: нитрат-нитритные портеры — NNP (nitrate-nitrite porters) и пептидные транспортеры — PTR (peptide transporter). Оба семейства представлены у про­кариот и эукариот и относятся к главному суперсемейству транспортных бел­ков MFS. К нему же относятся и фосфатные транспортеры, о которых речь шла выше (см. подразд. 6.3.1.3).

Методами молекулярной биологии были идентифицированы два семейства генов: NRT1 (nitrate reductase transporter) — кодируют переносчики с двойст­венными свойствами (с высокими и низким К_т), или переносчики низкого срод­ства, и NRT2 — кодируют индуцируемые переносчики NO высокого сродства.

При изучении и описании поглощения нитрата растениями обязательно следует принимать во внимание, что это результат двух разнонаправленных потоков: входа (influx) и выхода (efflux). Транспортная система выхода нитрата индуцируется самим нитратом и стимулируется аммонием. Однако, в отличие от индуцируемых систем транспорта входа, система выхода, будучи индуциро­ванной один раз, остается стабильной в присутствии ингибиторов РНК и син­теза белка в период до тех пор, пока нитрат и нитрит имеются в наличии в цитозоле. Возможно, это белок с большим периодом полуобновления, который работает как селективный канал. Транспортная система оттока кинетиче­ски описывается кривой насыщения с К_т = 5 мМ, что близко к значениям концентрации нитрата в цитозоле.

Транспорт нитрата через мембраны может быть важным звеном в регуляции усвоения нитрата в растении. На уровне плазмалеммы контролируется погло­щение нитрата из среды, на уровне тонопласта — накопление и ремобилизация запасенного ранее NO , на уровне транспорта через мембрану ЭР — симпластный транспорт на средние расстояния и, наконец, выход нитрата из кле­ток стелярной паренхимы определяет загрузку ксилемы — наименее изучен­ный транспортный поток нитрата.

Накопление и компартментация нитрата в растительных тканях. Накоплен­ный в растительных тканях нитрат асимметрично распределен между двумя основными клеточными компартментами: цитозолем и вакуолью (рис. 6.38). По мере накопления сперва заполняется доступный для восстановления метабо­лический пул (МП) в цитозоле, затем формируется запасной, или вакуолярный, пул (ЗП). Различия по содержанию нитрата (мкМ NO /г сырой массы) у растений, выращенных при разной его доступности, связаны в первую оче­редь с размерами ЗП. Однако на уровне клетки нитрат еще и перемещается по симпласту. Поэтому более достоверно компартментацию нитрата отражает трехкомпартментная модель, которая учитывает, наряду с метаболическим и за­пасным, подвижный пул (ПП) нитрата (рис. 6.38).

Рис. 6.38. Схема компартментации нитрата на уровне клетки:

МП — метаболический пул; ЗП — запасной пул; ПП — подвижный пул нитрата;

HP — нитратредуктаза

Восстановление нитрата. Характеристика нитратредуктазы. Восстановление нитрата в растениях (а также в водорослях, грибах и микроорганизмах) осуще­ствляется в две стадии: первая — двухэлектронное восстановление нитрата до нитрита, катализируемое нитратредуктазой (HP), вторая — шестиэлектронное восстановление нитрита до аммония, катализируемое нитритредуктазой (НиР). Далее аммоний включается в состав аминокислот в реакциях первично­го аминирования и амидирования:

Первая реакция самая медленная и лимитирует весь процесс в целом. Нит­рит и аммоний токсичны для растения и в норме не накапливаются. Их кон­центрации в листьях составляют ~15 нМ и ~10 мкМ на 1 г сырой массы соот­ветственно.

По структуре HP (ЕС 1.6.6.1) — металлофлавопротеин, образующий гомодимеры с молекулярной массой 100 кДа, и гомотетрамеры. Каждая субъедини­ца состоит примерно из 1000 аминокислот и включает три кофактора: ФАД, гем-Fe (цитохром b₅) и молибдоптерин, которые обеспечивают передачу элек­тронов от НАДН на NO (рис. 6.39). Их окислительно-восстановительные по­тенциалы (Е°') соответственно равны -272, -160 и -10 мВ. Фермент имеет центры связывания с НАДН и нитратом. Большинство форм HP у растений используют в качестве восстановителя НАДН, но некоторые (соя, кукуруза, ячмень, рис) биспецифичны и связываются либо с НАДН, либо НАДФН. Электроны от восстановителя передаются на ФАД, затем через геминовое же­лезо на молибден и далее на нитрат (рис. 6.39).

Рис. 6.39. Функциональная модель мономера HP

HP локализована в цитозоле. У большинства видов она обнаружена как в корнях, так и в листьях. У клюквы, белого клевера, цикория HP локализована только в корнях, а у Cocklebur— исключительно в листьях. На схеме (рис. 6.40) представлены данные по распределению ассимиляции нитрата между корнями и листьями у разных видов растений.

Рис. 6.40. Вклад корней и листьев в усво­ение нитрата у разных видов растений

В корнях при низких экзогенных концентрациях нитрата HP обнаруживается в эпидермальных и кортикальных клетках ближе к поверхности корня. При высоких концентрациях NO в среде HP есть во всех клетках коры и стели. В листьях С₄-растений HP локализована в клетках ме­зофилла, но не в клетках обкладки, так как хлоропласты мезофилла в большей степени продуцируют восстановитель при нециклическом фотосинтетическом транс­порте электронов.

Регуляция активности HP. Регуляция активности HP может осуществляться на стадии транскрипции, трансляции и на пост-трансляционном уровне.

Транскрипционный уровень. HP — фермент, индуцируемый субстратом, со временем полуобновления t ~ 4—5 ч. Индукция нитратом зависит от консти­тутивного «нитрат-сенсорного» белка неизвестной природы, который предпо­ложительно связывается с регуляторной областью гена HP. Регуляторная пос­ледовательность, или «нитратный бокс», в промоторе HP идентифицирована. В ответ на поступление нитрата уровень мРНК (HP) быстро увеличивается в течение минут и достигает стационарного состояния в течение нескольких ча­сов. Чувствительность индукционной системы регуляции: 50 мкМ NO в те­чение 10 мин. Изменения в уровне мРНК (HP) наблюдаются в ответ и на другие сигналы: свет, углеводы (сахароза), глутамин. Действие света опосредо­вано через фитохром. Наиболее четко индукция HP светом проявляется у этио­лированных проростков. В темноте накопление Сахаров коррелирует с повыше­нием уровня мРНК (HP). Увеличению концентрации Глу—NH₂ соответствует снижение количества транскриптов HP. У растений в стационарном состоянии с индуцированной HP количество мРНК демонстрирует суточную периодич­ность с максимумом в предрассветные часы. Возможно, в промоторной облас­ти гена HP есть места связывания с разными регуляторными белками, воспри­нимающими свет, концентрацию Глу—NH₂, водный и углеродный статус, ско­рость фотосинтеза и другие лимитирующие условия, которые модулируют вос­становление нитрата на транскрипционном уровне.

Этап трансляции генетической информации также может быть местом регу­ляции ассимиляции нитрата, но этот вопрос изучен недостаточно.

Пост-трансляционный уровень. Потенциальная активность HP зависит от: 1) количества функционально активного белка HP; 2) уровня активности белка HP и 3) доступности субстратов в цитозоле.

Доступность отдельных структурных компонентов не лимитирует количе­ство функционально активного белка HP. Однако у растений в условиях оптимального роста и достаточного снабжения нитратом потенциальная возможность его восстановления (количество функционально актив­ного белка, активность HP in vitro) больше, чем реальная активность HP (in vivo).

В основе механизма управления активностью фермента лежит про­цесс быстрой и обратимой инакти­вации HP, который происходит в два этапа (рис. 6.41): первый — фосфорилирование активной HP Са²⁺-зависимой протеинкиназой по серину «пер­вой петли»; второй — связывание 14-3-3-белка с фосфорилированной HP и переход HP в неактивное состояние. На втором этапе необходимо наличие ионов Mg²⁺ или Са²⁺. Сродство фермента к субстратам в неактивном состоянии не меняется, но блокируется поток электронов от гема на молибдоптериновый домен фермента.

Регуляция на уровне транскрипции и обратимая инактивация фермента совместно позволяют растениям точно настраивать интенсивность ассимиля­ции нитрата в соответствии с конкретным состоянием. Например, транскрип­ция HP в фотосинтезирующих тканях подчиняется циркадному ритму. Гены HP наиболее интенсивно транскрибируются в предрассветные часы, но синте­зируемый белок HP в это время обратимо ингибируется темнотой и низкой доступностью СО₂.

Метаболитная регуляция на пост-трансляционном уровне определяется со­держанием свободного Глу—NH₂ и отношением Глу—NH₂/Глу. Когда уровень Глу—NH₂ низкий и нитрат доступен, скорость восстановления нитрата возра­стает, в то время как высокий уровень Глу—NH₂ тормозит его восстановление. Предполагается, что регуляторная область связывания Глу—NH₂ расположена на N-конце фермента. У трансгенных растений с конститутивно экспрессированной мРНК (HP) и белком, у которого пост-трансляционный контроль по­терян в результате делеции N-конца, регуляторная роль Глу—NH₂ утрачивает­ся и восстановление контролируется только доступностью НАДН.

Рис. 6.41. Регуляция активности нитрат-редуктазы (HP) путем фосфорилирования и последующим связыванием с белком 14-3-4: ПК — протеинкиназа; ПФ — пирофосфатаза

Нитритредуктаза. Нитрит, образующийся при восстановлении нитрата, транспортируется в хлоропласты или пластиды в нефотосинтезирующих тка­нях, где восстанавливается до аммония. Нитритредуктаза (НиР) (ЕС 1.7.7.1), катализирующая эту реакцию, использует в качестве донора 6е восстановлен­ный ферредоксин:

NO + 6Фд_В0ССТ + 8Н⁺ → NH₄⁺ + 6Фд_0К + 2Н₂О

В хлоропластах восстановление нитрита через ферредоксин обеспечивается за счет нециклического потока электронов в ЭТЦ фотосинтеза, в нефотосинтетических тканях — за счет НАДФН из окислительного пентозофосфатного пути при участии

ферредоксин-НАДФ⁺-редуктазы:

НАДФН + 2Фд_ок(Fе³⁺) → НАДФ⁺ + 2Фд_восст(Fе²⁺) + Н⁺

НиР — мономер с молекулярной массой 60 — 70 кДа, состоит из двух доменов и кофакторов, которые передают электроны от ферредоксина на нитрит. Ферредоксин связывается с N-терми-нальной последовательностью белковой молекулы. На второй половине белка на С-конце локализовано место связыва­ния с нитритом. Это два железосерных центра [4Fe—4S] и сирогем (рис. 6.42).

Рис. 6.42. Функциональная модель нитритредуктазы

Активность НиР на порядок выше активности HP, поэтому нитрит в обыч­ных условиях не накапливается и ско­рость ассимиляции нитрата лимитирует первая реакция. НиР, так же как и HP, индуцируется нитратом (а не нитри­том) и светом.