95) . Способы идентификации вирусов ртга, рн, цветная реакция.

Реакция нейтрализации (РН) основана на способности антител нейтрализовать инфекционную активность вирусов в культурах ткани, РКЭ, чувствительных лабораторных животных. Из вирус-содержащего материала готовят десятикратные разведе­ния и добавляют к ним специфическую сыворотку в разведении в соответствии с титром, указанным на этикетке ампулы. Смеси вирус-сыворотка инкубируют 30 — 60 мин при 37 °С для обеспече­ния связывания антигенов с антителами, после чего смесью за­ражают культуру ткани, куриные эмбрионы или лабораторных животных. Контролем является чувствительная биосистема, заражен­ная вирусом без сыворотки. Реакция считается положительной в случае нейтрализации ЦПД в культуре клеток, а также при отсутствии патологических изменений в куриных эмбрио­нах или в организме животных. По результатам РН высчитывается индекс нейтрализации (ИН - отношение титра вируса в контроле к титру вируса в опыте). При ИН менее 10 реакция расценивается как отрицательная, от 11 до 49 — сомнительная, от 50 и выше — положительная.

Другим вариантом РН является цветная проба. Положительный результа­т пробы в случае соответствия вируса противовирусным антителам проявляется блокадой репродукции вируса, клетка при этом остается жизнеспособной, вырабатывая кислые продукты метаболизма, под влиянием которых цвет индикатора (фенолового красного) меняется с красного на желтый. Для постановки пробы в пробирки вносят по 0,25 мл рабочего разведения вируса и соответствую­щую антисыворотку. Смесь выдерживают при комнатной температуре 30-60 мин, добавляют в каждую пробирку по 0,25 мл клеточной суспензии и закрывают их резиновыми пробками. Пробирки инкубируют в термостате при 37⁰ С 6-8 дней, результаты реакции учитыва­ют по изменению цвета индикатора (красный цвет индикатора соответствует щелочному характеру рН - 7,4 указывая на репродукцию вируса и подавление метаболизма клеток; желтый цвет свидетельствует о кислом рН - ниже 7,2 в результате нейтрализации вируса антителами и активном метаболизме клеток с выработкой кислых продуктов обмена).

Реакция торможения гемаггяютинации (РТГА) является одним из вариантов РН и ос­нована на нейтрализации гемагглютинирующих свойств вирусов специфичес­кими антителами, что проявляется отсутствием агглютинации чувствительных эритроцитов с формированием на дне пробирки или лунки полистиролового планшета компактного осадка вместо «зонтика». РТГА используется как для определения антител в качестве метода серологической диагностики, так и для идентификации вирусов, обладающих гемагглютининами. Феномен РТГА проявляется в образова­нии компактного осадка эритроцитов вместо «зонтика» гемагглютинации. Перед постановкой РТГА сыворотки обрабатывают периодатом калия, каолином, бентонитом, ацетоном или други­ми веществами для удаления неспецифических ингибиторов гемагглютинации. После этого к двукратным разведениям сыворотки добавляют равное количество вируссодержащей жидкости с активностью 4 ГЕ, смесь инкубиру­ют 30-60 мин при оптимальной для данного вируса температуре (4⁰, 20⁰, 37⁰ С), а затем добавляют равный объем 0,5-1,0% взвеси эритроцитов. Смесь снова инкубируют 30-45 мин и производят учет результатов реакции. Титром сыворотки считают ее наибольшее разведение, которое вызывает торможение гемагглютинации.

Реакция торможения гемадсорбции (РТГадс) ос­нована на нейтрализации эффекта адсорбции эритроцитов на по­верхности клеток, инфицированных вирусами, способными вызывать гемадсорбцию. Для постановки реакции по 0,2 мл специфической сыворотки, разведенной 1:5, вносят в пробирки, инкубируют 30-60 мин в термостате при оптимальной для данного вируса температуре, затем добавляют по 0,2 мл 0,5% взвеси эритроцитов. Контрольные пробы содержат неиммунную сыворотку и эритроциты. Пробирки снова инкубируют 20-30 мин, после чего производят учет реакции. Идентификация вируса основывается на признаке отсутствия адсорб­ции эритроцитов на клетках в присутствии иммунной сыворотки при наличии гемадсорбции в конт­рольных пробирках.

96) . Вирусы, их строение, биологические свойства, размножение вирусов, культивирование в живых системах. Классификация вирусов. Вирусы – доклеточные формы жизни, которые являются облигатными внутриклеточными паразитами, т. е. могут существовать и размножаться только внутри организма хозяина. Основные свойства вирусов (и плазмид), по которым они отличаются от остального живого мира. 1.Ультрамикроскопические размеры (измеряются в нанометрах). Крупные вирусы (вирус оспы) могут достигать размеров 300 нм, мелкие- от 20 до 40 нм. 1мм=1000мкм, 1мкм=1000нм. 2.Вирусы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа- или ДНК (ДНК- вирусы) или РНК (РНК- вирусы). У всех остальных организмов геном представлен ДНК, в них содержится как ДНК, так и РНК. 3.Вирусы не способны к росту и бинарному делению. 4.Вирусы размножаются путем воспроизводства себя в инфицированной клетке хозяина за счет собственной геномной нуклеиновой кислоты. 5.У вирусов нет собственных систем мобилизации энергии и белок- синтензирующих систем, в связи с чем вирусы являются абсолютными внутриклеточными паразитами. 6.Средой обитания вирусов являются живые клетки- бактерии (это вирусы бактерий или бактериофаги), клетки растений, животных и человека. Все вирусы существуют в двух качественно разных формах: внеклеточной- вирион и внутриклеточной- вирус. Таксономия этих представителей микромира основана на характеристике вирионов- конечной фазы развития вирусов.

Строение (морфология) вирусов. 1.Геном вирусов образуют нуклеиновые кислоты, представленные одноцепочечными молекулами РНК (у большинства РНК- вирусов) или двухцепочечными молекулами ДНК (у большинства ДНК- вирусов). 2.Капсид — белковая оболочка, в которую упакована геномная нуклеиновая кислота. Капсид состоит из идентичных белковых субъединиц- капсомеров. Существуют два способа упаковки капсомеров в капсид- спиральный (спиральные вирусы) и кубический (сферические вирусы). 3.Просто устроенные вирусы имеют только нуклеокапсид, т.е. комплекс генома с капсидом и называются “голыми”. 4. У других вирусов поверх капсида есть дополнительная мембраноподобная оболочка, приобретаемая вирусом в момент выхода из клетки хозяина- суперкапсид. Такие вирусы называют “одетыми”. Кроме вирусов, имеются еще более просто устроенные формы способных передаваться агентов — плазмиды, вироиды и прионы.

Размножение вирусов

При внедрении вируса внутрь клетки-хозяина происходит освобождение молекулы нуклеиновой кислоты от белка, поэтому в клетку попадает только чистый и незащищенный генетический материал. Если вирус ДНК, то молекула ДНК встраивается в молекулу ДНК хозяина и воспроизводится вместе с ней. Так появляются новые вирусные ДНК. Все процессы, протекающие в клетке, замедляются, клетка начинает работать на воспроизводство вируса. Так как вирус является облигатным паразитом, то для его жизни необходима клетка-хозяин, поэтому она не погибает в процессе размножения вируса. Гибель клетки происходит только после выхода из нее вирусных частиц.

Ретровирус, обеспечивающие обратную транскрипцию: на матрице РНК строится одноцепочечная молекула ДНК. Из свободных нуклеотидов достраивается комплементарная цепь, которая и встраивается в геном клетки-хозяина. С полученной ДНК информация переписывается на молекулу и-РНК, на матрице которой затем синтезируются белки ретровируса. Основные методы культивирования вирусов: 1) биологический – заражение лабораторных животных. 2) культивирование вирусов в развивающихся куриных эмбрионах.

КЛАССИФИКАЦИЯ ВИРУСОВ
ДЕЗОКСИВИРУСЫ			РИБОВИРУСЫ
1. ДНК двухнитчатая	2. ДНК однонитчатая	1. РНК двухнитчатая		2. РНК однонитчатая
1.1. Кубический тип симметрии: 1.1.1. Без внешних оболочек:аденовирусы 1.1.2. С внешними оболочками:герпес-вирусы1.2. Смешанный тип симметрии:Т-четные бактериофаги 1.3. Без определенного типа симметрии:оспенные вирусы	2.1. Кубический тип симметрии: 2.1.1. Без внешних оболочек: крысиный вирус Килхама, аденосателлиты	1.1. Кубический тип симметрии: 1.1.1. Без внешних оболочек: реовирусы, вирусы раневых опухолей растений		2.1. Кубический тип симметрии: 2.1.1. Без внешних оболочек:вирус полиомиелита, энтеровирусы, риновирусы 2.2. Спиральный тип симметрии: 2.2.1. Без внешних оболочек:вирус табачной мозаики 2.2.2. С внешними оболочками:вирусы гриппа, бешенства, онкогенные РНК-содержащие вирусы

97) . Вирусологический метод исследования. Средства индикации и идентификации вируса. Вирусологические методы исследования используются также с целью идентификации вирусов, изучения их биологии и способности воздействовать на клетки животных и человека, что в дальнейшем помогает понимать патогенез вирусных заболеваний и правильно выбирать методы их лечения. Кроме установления этиологии заболевания и мониторинга эффективности терапии, вирусологические методы исследования имеют большое значение в определении и проведении противоэпидемических мероприятий. ПРЯМЫЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В ВИРУСОЛОГИИ Прямые вирусологические методы исследования позволяют обнаружить вирус, вирусную нуклеиновую кислоту или вирусный антиген непосредственно в клиническом материале и являются, таким образом, наиболее быстрыми (экспресс-методы – до 24 ч). Данные методы менее информативны и требуют лабораторного подтверждения непрямыми методами диагностики в связи с нередким получением ложноотрицательных или ложноположительных результатов. К прямым относятся следующие методы исследования: • электронная микроскопия с окрашиванием вирусов методом негативного контрастирования • иммунная электронная микроскопия, основанная на взаимодействии специфических антител с вирусами с образованием комплексов, которые легче обнаруживаются при негативном контрастировании, нежели вирусы отдельно; • твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием меченных ферментами антител, • реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – прямая или непрямая – основана на применении антител, связанных с флюоресцентным красителем; • радиоиммунный анализ (РИА) основан на использовании меченных радиоизотопами антител и гамма-счётчиков; • цитологические методы основаны на микроскопическом исследовании окрашенных мазков, биоптатов, материалов аутопсии; • молекулярные методы – молекулярная гибридизация нуклеиновых кислот и полимеразная цепная реакция.

НЕПРЯМЫЕ ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Данные методы основаны на выделении и идентификации вируса. Материалом для таких исследований может быть содержимое везикул, соскобы (при ветряной оспе, герпетическом поражении кожи и слизистых оболочек), носоглоточный смыв (при респираторных инфекциях), кровь и ликвор (при арбовирусных инфекциях), фекалии (при энтеровирусных инфекциях), смывы (при кори, краснухе и др.). В связи с тем, что вирусы способны размножаться только в живых клетках, культивирование вируса осуществляют в культуре ткани, курином эмбрионе или в организме животного. Индикацию вируса проводят по цитопатическому действию, в реакции гемадсорбции, по цветной пробе, по результатам реакции торможения гемагглютинации, по изменениям или их отсутствию в куриных эмбрионах или культурах ткани, по выживаемости чувствительных животных. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ В ВИРУСОЛОГИИ Под серологической диагностикой подразумеваются вирусологические методы исследования, основанные на реакции антиген-антитело. При этом чаще всего используются парные сыворотки крови, которые берутся с интервалом в несколько недель. При нарастании титра антител в 4 и более раз реакция считается положительной. Для определения типоспецифичности вирусов применяется реакция вируснейтрализации, с целью определения группоспецифичности – реакция связывания комплемента. Также широко применяются реакции пассивной гемагглютинации, торможения гемагглютинации, обратной пассивной гемагглютинации, РИФ и различные варианты иммуноферментного анализа. Методы индикации и идентификации вирусов в клеточных культурах При заражении вирусами клеточных культур можно получать различные видимые проявления действия вируса:

• Цитопатическое действие вируса на культуру клеток (ЦПД)  • Приобретение заражённой культурой клеток способностик гемадсорбции  • Образование в заражённой клеточной культуре под плотным слоем специального агарового покрытия характерных бляшек, являющихся «негативными колониями» вирусов; • Подавление процессов метаболизма в заражённой вирусом культуре клеток, выявляемое с помощью так называемой цветной пробы.

Окончательная идентификация выделенного вируса проводится с помощью реакции нейтрализации с диагностическими вируснейтрализующими сыворотками. Определяют их родовую и видовую принадлежность Реакция нейтрализации — реакция торможения гемагглютинации (РТГА). РТГА применяется: -для серотипирования вирусов; -для серодиагностики инфекций..

РТГА. Цель: серотипирование вируса гриппа А Компоненты: 1. Исследуемый материал — аллантоисная жидкость куриного эмбриона, 2. Диагностические противогриппозные типоспецифиче-ские сыворотки, 3. 5 % взвесь куриных эритроцитов. 4. Физиологический раствор. Реакция ставится на стекле капельным способом. На стекло наносят по 1 капле диагностических сывороток и исследуемого материала, перемешивают, затем добавляют 1 каплю взвеси эритроцитов. При положительной реакции наблюдается гомогенное покраснение, а при отрицательной выпадение хлопьев красного цвета (гемагглютинация). Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) В основе РГА лежит способность эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов.В качестве исследуемого материала при гемагглютинации используют аллантоисную, амниотическую жидкость. РГА не является серологической, поскольку происходит без участия иммунной сыворотки и используется для выбора рабочего разведения антигена для постановки РТГА или наличия антигена (вируса) в исследуемом материале (например, при гриппе). В реакции используются эритроциты животных, птиц, человека I (0) группы крови.

Для постановки ориентировочной РГА на предметное стекло наносят каплю 5% взвеси эритроцитов и каплю испытуемого материала, тщательно смешивают. При положительном результате через 1-2 минуты макроскопически наблюдают появление хлопьевидной агглютинации эритроцитов. Для постановки РГА в развернутом ряду в лунках полистероловых планшетов готовят двукратно возрастающие разведения исследуемого материала на физиологическом растворе в объёме 0,5 мл. Во все пробирки вносят по 0,5 мл 0,25 - 1% взвеси эритроцитов. Результаты учитывают после полного оседания эритроцитов в контроле (эритроциты + физиологический раствор). Реакцию учитывают по характеру осадка эритроцитов. В положительных случаях степень агглютинации отмечают плюсами. Резко очерченный осадок эритроцитов, неотличимый от контроля показывает отсутствие агглютинации. При положительном результате РГА исследование продолжают, определяя тип выделенного вируса с помощью реакции торможения гемагглютинации типоспецифическими сыворотками.