5. Контроль відходів біотехнологічних виробництв

Л А Б О Р А Т О Р Н А Р О Б О Т А № 5.1

Контроль стічних вод а) Визначення сполук сірки у промислових стоках

Якісне визначення сірководню.

Суть методу

Сірководень лего визначаєть по запаху на місці взяття проби чи після швидко доставки її в лабораторію.

Методика визначення

В закритому бутлі, заповненому на ¾ водою між горлом та корком поміщають індикаторний свинцевий папірець, змочений дистильованою водою, потемніння якого вказує на присутність вільного сірководню, а потемніння його лише після підкислення проби - зв’язаного сірководню.

Примітка

Індикаторний свинцевий папірець одержують смочуванням фільтрувальної смужки оцтовою кислотою та 5% розчином ацетату свинцю.

Реактиви та обладнання: промивні води від етилтіосульфонату Na, оцтова кислота,5%-ний розчин ацетату свинцю, індикаторний свинцевий папірець

б) Бактеріологічний аналіз стоків

Суть методу

Визначення числа бактерій, що знаходяться у воді. Для питної води допустиме число бактерій < 100 кл/мл

Індикатор хвороботворності (Колі-індекс) кишкова паличка - E.coli.

Методика визначення:

Краплю води розглядають під мікроскопом і визначають типи мікроорганізмів, які є в пробі.

Ультрафільтр №3 закладають стерильним пінцетом, а під нього стерильне кружальце фільтрувального паперу, змоченого стерильною водою. Пробу досліджуваної питної води об’ємом 300 мл фільтрують (стічну воду розводять в 100 раз). Відтак, мембранний фільтр стерильним пінцетом (флембованим на вогні) кладуть в чашку Петрі з живильним середовищем Ендо. Чашку Петрі закривають і кладуть переверненою в термостат на 24 год при температурі 37^оС (оптимальні умови росту бактерій). Колонії, що виросли в чашці, і забарвлені у червоний колір з металевим блиском, підраховують під лупою.

Примітка

Кількість колоній у пробі визначає Колі-індекс.

Для проведння швидшого бактеріологічного аналізу використовують ультрафільтри, що затримують бактерії, які вираховують під мікроскопом після культивування в термостаті на живильних средовищах. Через фільтр №1 з середнім діаметром пор 0,35 мк фільтрують 500 мл води за 9 хв, № 2 –0,5мк – за 4,5хв, № 3 - 0,7 мк – за 2,25 хв.

Перед проведенням аналізу фільтрувальний аппарат та ультрафльтри стерилізують кип’ятінням 30-40 хв, посуд – сухим жаром при 160⁰ С протягом 1 год, дистильовану воду кип’ятінням протягом 1 год.

Реактиви та обладнання: хімічні стоки, стоки пивзаводу, їдільні, лікарні, фільтрувальний папір, середовище Ендо, мікроскоп, пінцет, чашки Петрі. В) Визначення рН

В забарвлених та мутних сточних водах рН визначають універсальним індикатором або потенціометром (соляний електрод). В незабарвлених стоках рН можна визначати також колориметром.

6. Контроль біоматеріалів

Л А Б О Р А Т О Р Н А Р О Б О Т А № 6.1

Кількісне визначення каротинів у різних рослинних об’єктах

Суть методу:

Свіжий рослинний матеріал розтирають з безводним натрій сульфатом, екстрагують бензином каротини, відділяють їх від інших пігментів хроматографією, бензиновий елюат колориметрують.

Методика визначення:

Рослинний матеріал (листя, пагони, квітки й інші органи рослин) масою 0,5-1,0 г розтирають у ступці з 2 г безводного натрій сульфату і 0,5 г магній карбонату. Після розтирання суміш залишають на 5 хвилин для підсушування. Після цього її наносять на хроматографічну колонку. Колонка – це скляна трубка діаметром 15-20 мм, довжиною 120-150 мм, у нижній частині звужена, а у верхній – розширена. В нижню частину колонки вміщують тампон зі скловати, потім насипають 10 г добре розтертої в ступці суміші натрій оксалату й тальку (1:1) і ущільнюють. Зверху також кладуть тампон зі скловати, щоб порошок не змочувався. Хроматографічну колонку прилаштовують до колби Бунзена, що приєднана до насоса.

Після нанесення розтертої і підсушеної маси ступку обполіскують 5 мл бензину, який виливають у колонку. Потім вмикають насос і відсмоктують бензиновий екстракт зі швидкістю 50-60 крапель за хвилину. Колонку промивають порціями бензину по 3 мл до повного видалення нижньої жовтогарячої смуги каротинів, яка знаходиться попереду інших пігментів. За нею розташована жовта смуга ксантофілів, а вище – синя смуга хлорофілу. Розчин каротинів доводять бензином до повного об’єму (10 або 15 мл), колориметрують із світлофільтром з довжиною хвилі 490 нм.

Примітки

Для виготовлення такого розчину калій дихромат масою 72 мг вносять у мірну колбу на 100 мл, розчиняють, об’єм доводять до риски і ретельно перемішують. Один кубічний сантиметр такого розчину відповідає 0,00416 мг каротину.

Екстинкцію бензинового елюату порівнюють з ексинкцією стандартного розчину. Замість стандартного розчину каротину можна використати розчин калій дихромату, забарвлення якого схоже на забарвлення каротинів.

Вміст каротину в досліджуваному матеріалі розраховують за формулою

Х = 100 · D₁ · m · V / a · D₂,

де Х – вміст каротинів у рослинному матеріалі, мг %; a – маса рослинного матеріалу, г; D₁ – екстинкція досліджуваного розчину каротинів; D₂ – екстинкція стандартного розчину K₂Cr₂O₇; m – вміст каротинів у стандартному розчині, мг/мл; V - об’єм бензинового елюату каротинів, мл.

Реактиви: листя, пагони, квітки й інші органи рослин, 2 г безводного натрій сульфату, 0,5 г магній карбонату, 5 мл бензину

Л А Б О Р А Т О Р Н А Р О Б О Т А № 6.2

Визначення вмісту АТФ у біологічному матеріалі

Принцип методу:

Із безбілкового екстракту з біологічного матеріалу виділяють АТФ у вигляді ртутної солі, проводять її гідроліз у середовищі хлоридної кислоти протягом 7 хвилин при 100^оС. У гідролізаті визначають приріст неорганічного фосфату за методом Фіске-Суббароу.

Інші фосфатні естери, що містяться в безбілковому екстракті, не заважають визначенню АТФ, оскільки при обробці екстракту меркурій ацетатом вони залишаються в розчині і відділяються від нерозчинної ртутної солі АТФ.

Методика визначення:

До 1 мл крові (чи кислотних, водних і спиртовий витяжок з тканин) додають 1 мл холодного розчину трихлороцтової кислоти 10%-ної для осадження білків. Якщо роботу проводять з кислоторозчинною фракцією тканини, то цю операцію опускають. Через 30 хвилин осад білка відділяють центрифугуванням при 3000 обертів протягом 10 хвилин. До надосадової рідини додають 0,5 мл розчину меркурій ацетату 20%-ного, добре перемішують і через 15 хвилин центрифугують. Надосадову рідину зливають, а осад 2 рази промивають 1-2 мл розчину меркурій ацетату 0,5%-ного. Потім осад розчиняють в 1 мл рочину хлоридної кислоти (С=0,1 моль/л), доводять водою до 3 мл і добре перемішують. З розчину відбирають по 1 мл у дві пробірки. В одну пробірку додають 1 мл розчину хлоридної кислоти (С = 2,0 моль/л), нагрівають протягом 7 хвилин на киплячій водяній бані. Охолоджують, додають краплю розчину фенолфталеїну і нейтралізують розчином натрій гідроксиду (С = 5,0 моль/л), до слабко-рожевого забарвлення. Нейтралізований розчин кількісно переносять у мірну колбу на 25 мл, пробірку декілька разів ополіскують невеликими порціями дистильованої води, яку зливають у цю ж мірну колбу. Вміст колби переводять у слабкокисле середовище додаванням декількох крапель розведеної сульфатної кислоти 5-10%-ної, вносять 5-7 мл розчину амоній молібдату 2,5%-ного в розчині сульфатної кислоти (С_1/2 = 5,0 моль/л), 20-30 мг кристалічної аскорбінової кислоти, перемішують пеервертанням колби, доводять водою до мітки, переносять розчин з мірної колби у конічну і нагрівають до 40-50^оС на водяній бані до появи забарвлення. Забарвлений синій розчин колориметрують проти контролю на реактиви з світлофільтром з довжиною хвилі 590 нм. Контроль на реактиви містить всі компоненти, крім екстракту з біологічного матеріалу.

У другій пробірці, де не відбувається гідроліз ртутної солі АТФ, визначають можливі залишки неорганічного фосфату, захоплені осадом ртутної солі АТФ, як описано вище.

Для визначення неорганічного фосфату готують стандартний розчин фосфату. Кристалічний КН₂РО₄ масою 0,1099 г розчиняють у дистильованій воді і мірній колбі на 1 л і доводять водою до мітки. В 1 мл цього розчину міститься 0,025 мг фосфору.

У колби на 25 мл вносять 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 м стандартного розчину фосфату і обробляють так, як і дослідні проби. Будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі ординат оптичну густину,а на осі абсцис – вміст фосфору в пробі.

Примітки

Приріст неорганічного фосфату внаслідок гідролізу АТФ визначають як різницю між вмістом неорганічного фосфату після проведення гідролізу АТФ і без проведення гідролізу, тобто фосфату, що був захоплений ртутним осадом.

За калібрувальним графіком знаходять вміст фосфору в досліджуваних пробах.

Вміст АТФ у досліджуваному матеріалі визначають із співвідношення:

m(АТФ)/m(Р) = M(АТФ)/2·M(P); m(АТФ) = M(АТФ)·m(P)/2·M(P),

m(Р) = m₁ – m₂,

де m₁ – маса фосфору в пробі після кислотного гідролізу АТФ, мкг;

m₂ – маса фосфору в пробі без проведення гідролізу АТФ, мкг;

С = m(Р) ·1000· М(АТФ) / V·2M(P)·μM,

де С – концентрація АТФ у досліджуваному екстракті, мкмоль/л; m(Р) – маса фосфору в пробі, мкг; М(АТФ) – молярна маса АТФ, г/моль; M(P) – молярна мас фосфору, г/моль; V – об’єм екстракту, взятий дял аналізу, мл; 1000 – перерахунок на 1 л екстракту з біологічного матеріалу; μM – мікромолекулярна маса АТФ, мкг/моль.

Вміст АТФ у різних тканинах різний. Так. У печінці щурів він складає 1,7 мкмоль на 1 г тканини, у серцевому м’язі цих тварин – 13,3 мкмоль на 1 г тканини. У крові людини вміст АТФ становить близько 600 мкмоль/л.

Реактиви: кислотні, водні і спиртові витяжки з тканин, 1 мл холодного розчину трихлороцтової кислоти 10%-ної, 0,5 мл розчину меркурій ацетату 20%-ного, хлоридної кислоти (С = 0,1 моль/л), 1 мл розчину хлоридної кислоти (С = 2,0 моль/л), розчином натрій гідроксиду (С = 5,0 моль/л), розведена сульфатна кислота 5-10%-ної, 7 мл розчину амоній молібдату 2,5%-ного в розчині сульфатної кислоти (С_1/2 = 5,0 моль/л), 20-30 мг кристалічної аскорбінової кислоти, КН₂РО₄

Л А Б О Р А Т О Р Н А Р О Б О Т А № 6.3

Кількісне визначення вмісту міді в біологічних об’єктах за допомогою йон-селективних електродів

Методика визначення:

Для вивільнення зв’язаної міді біологічний матеріал мінералізують. У колбу К’єльдаля вносять 2 мл сироватки крові (чи відповідний об’єм гомогенату іншої тканини), додають 10-12 крапель сульфатної кислоти (d=1,84 г/мл), колбу нагрівають у витяжній шафі до появи білого диму. Маса набуває чорного кольору. Колбу охолоджують, додають 15-20 крапель пергідролю і знву сильно нагрівають до повного знебарвлення вмісту колби. При потребі вносять в охолоджену колбу додатково пергідроль, якщо при першому внесенні не відбулося знебарвлення. Після повної мінералізації кислоту нейтралізують розчином NaOH 30%-ним за фенолфталеїном. Вміст колби переносять у невелику склянку, занурюють у розчин йон-селективний до Сu²⁺ електрод і електрод порівняння. Електроди приєднують до рН-метра-мілівольтметра і вимірюють величину електродної функції. За калібрувальним графіком знаходять концентрацію Сu²⁺ в мкмоль/л. Роблять перерахунки на вміст міді в мкмоль/л сироватки крові.

У нормі вміст міді в сироватці крові становить 11-23 мкмоль/л у чоловіків і 13,4-24,4 мкмоль/л – у жінок.

Користуючись довідниками, складіть список ферментів, які активуються чи інгібуються йонами купруму.

2