4. Контроль продукції

Л А Б О Р А Т О Р Н А Р О Б О Т А № 4

Електрофоретичне визначення глюкозооксидази

Суть методу:

Глюкозооксидаза (аеробна оксидоредуктаза, дегідрогеназа) - флавопротеїновий фермент з двома флавінаденіндинуклеотид-ними групами (ФАД) в молекулі. Фермент контролює окислення D-глюкози молекулярним киснем з утворенням глюконової кислоти та пероксиду водню як кінцевих продуктів в кількостях еквімолярних окисленій глюкозі, проявляючі антибактеріальну активність при наявності глюкози та вільного кисню. Механізм антибактеріальної активності глюкозоксидази пояснюється дією пероксиду водню. ЇЇ застосовують в клінічній медицині як специфічного реактиву для визначення глюкози в крові, сечі та інших біологічних рідинах, для приготування діагностичного паперу, антиоксидантного препарату.

Реакція окислення D-глюкози, що каталізується глюкозоксидазою протікає за схемою:

-СОН + Н₂О + О₂ = -СООН + Н₂О₂ за реакціями:

глюкозоксидаза + -D-глюкоза +Е-ФАД ---> D-глюконо-  -лактон + Е-ФАД-Н₂

Е-ФАД-Н₂+О ₂ ----> Е-ФАД + Н₂О₂

D-глюконо--лактон + Н₂О -------> Глюконова кислота

За одиницю активності глюкозооксидази приймають таку кількість ферменту, що відповідає споживанню 22,4 мкл за 1 хв при оптимальних умовах (в апараті Варбурга при температурі 30 ^оС, надлишку глюкози, рН 5,8, в атмосфері кисню). При температурі 20^оС 1 од.активності зв'язує 24,034 мкл О₂ /хв.

Активність ферменту повинна бути не менше, ніж 600 од/г.

Приготування реактивів:Для розділення суміші кислих білків застосовують гелі з лужною системою буферів з рН = 8,9, а основних білків – кислотною системою з рН = 4.3.

У роботі застосовується гель з рН = 8,9.

Приготування вихідних розчинів для полімеризації гелю.

Розчин №1 (рН 8,9)

Розчин хлоридної кислоти (С=1,0 моль/л) – 48 мл;

Трис-оксиметиламінометан – 36,6 г;

N,N,N’,N’ –тетраметилетилендіамін – 0,23 мл;

Вода дистильована – до 100 мл.

Розчин №2

Акриламід – 28 г;

N,N’–метилен-біс-акриламід – 0,735 г;

Вода дистильована – до 100 мл

Розчин №3

Амоній пентаоксидсульфат (NH₄)₂SO₅ – 0,14 г;

Вода дистильована – до 100 мл

Розчин №4 (рН 6,9)

Розчин хлоридної кислоти (С=1,0 моль/л) – 48 мл;

Трис-оксиметиламінометан – 5,98 г;

N,N,N’,N’ –тетраметилетилендіамін – 0,46 мл;

Вода дистильована – до 100 мл

Розчин №5

Акриламід – 10 г;

N,N’–метилен-біс-акриламід – 2,5 г;

Вода дистильована – до 100 мл

Розчин №6

Рибофлавін – 0,004 г;

Вода дистильована – до 100 мл

Буферна система для електродних склянок (рН 8,3)

Трис-оксиметиламінометан – 0,6 г;

Гліцин – 2,9 г;

Вода дистильована – до 100 мл

Антиконвекційне середовище

Розчин ;4 – 0,25 мл;

40%-ний розчин сахарози – 1 мл;

Розчин з глюкозооксидазою – 0,1 мл.

Приготування гелів та підготовка приладу до роботи:

Перед полімеризацією гелів необхідно ретельно вимити і висушити скляні трубки, закрити їх з одного кінця втулками і встановити в штатив.

Для приготування дрібнопористого гелю необхідно змішати в колбочці на 50 мл одну частину розчину №1, дві чатини розчину №2, чотири частини розчину №3 і одну частину дистильованої води.

Піпеткою з відтягнутим кінцем залити отриману суміш у трубки для нижнього гелю до мітки на штативі, стежачи за тим, щоб не потрапили бульбашки повітря.

Нашарувати обережно із піпетки з відтягнутим кінцем воду висотою стовпчика 5-7 мм для вирівнювання менісків, а також для того, щоб не було доступу кисню повітря до суміші, де відбувається полімеризація акриламіду.

Після цього залишають на 60-90 хвилин для полімреизації. Полімеризацію можна прискорити при освітленні трубок лампою денного світла, яку розташовують поблизу трубок, і слабким підігрівом. Кінець полімеризації визначається появою чіткої межі між гелем і водою.

Для приготування крупнопористого (внрхнього гелю змішують у колбочці на 50 мл одну частину розчину ;4, дві частини розчину №5, одну частину розчину №6 і чотири частини води. При виконанні цієї роботи слід уникати яскравого світла.

Після полімеризації нижнього гелю ретельно видаляють воду з трубок за допомогою смужок фільтрувального паперу. Після цього обережно піпеткою з відтягнутим кінцем вносять суміш для верхнього гелю висотою стовпчика 5-7 мм. Зверху нашаровують воду для вирівнювання менісків і вмикають яскраве світло для фотополімеризації. Закінчення полімеризації визначається появою опалесценції в цій частині гелю. За допомогою смужок фільтрувального паперу видаляють воду з верхнього гелю.

Змішують 0,1 мл розчину глюкозооксидази з антиконвекційною сумішшю, що являє собою суміш 0,25 мл розчину №4 і 1 мл 40%-ного розчину сахарози. Цю суміш переносять у кожну трубочку зверху крупнопористого гелю з розрахунку 100-200 мкг білка на трубочку.

З нижніх частин трубочок знімають гумові втулки, рубочки встановлюють у верхній камері таким чином, щоб їхні верхні кінці виступали на 1-2 мм або були на одному рівні з ущільнюючими втулками. При установці трубок диск, що забезпечує вертикальне розташування трубок, повинен бути у верхньому положенні. Після того як трубочки будуть встановлені, диск опускають і фіксують за допомогою паза.

З нижніх кінців трубок за допомогою шприца з голкою, заповненого електродним буфером, видаляють бульбашки повітря. Труба, щоб при цьому кожна трубка мала краплину буферу, що звисає. Заливають буферний електродний розчин у нижню камеру до риски, встановлюють верхню камеру в нижню.

В одну турбку додають до білкової суміші трохи 0,001%-ного барвника бромфенолового синього для спостереження за рухом білка при електрофорезі. Бромфеноловий синій виступає у даному випадку в ролі маркера: він при електрофорезі і лужному гелі рухається попеерду першої фракції преальубміну.

Електродний буферний розчин заливають у верхню камеру.

Потім встановлюють камеру для електрофорезу в камеру для охолодження, заповнену водою з льодом, підключають змійовик до водопроводу. Далі камеру для електрофорезу підключають до електронного блоку живлення. При підключенні слід враховувати полярність електродів так, щоб білки під дією електричного поля рухалися в гелі зверху вниз. Для розділення кислих білків у лужному гелі верхній електрод має бути приєднаний до від’ємного (-) джерела струму, а нижній електрод камери – до позитивного (+) джерела.

Методика проведення електрофорезу:

До входження маркера в нижній гель (приблизно 30 хвилин)сила струму не повинна пеервищувати 2 міліампери на кожну турбочку (20 міліампер на 10 трубочок). Після цього струм збільшують до 4 міліампер на трубочку (40 міліампер на 10 трубочок) до закінчення процесу електрофорезу. Коли диск маркера знаходитиметься на відстані 5-7 мм від нижнього кінця гелю, процес електрофорезу припиняють.

Примітка.

Після електрофорезу обробляють гелеві стовчики. Розбирають камеру, виймають трубки. Для того, щоб видалити стовчики з трубок, трубку занурюють у посудину з водою, під водою вводять голку між стінкою трубки і стовпчиком гелю, відшаровують гель від стінок трубки і стовпчиком гелю, відшаровують гель від стінок трубки, після чого гель легко виймається. Вийняті стовпчики гелю вміщують на 30 хвилин у 5%-ний розчин трихлороцтової кислоти для фіксації. Після цього стовпчики вівдмивають декілька разів від трихлороцтової кислоти і вносять на 20 хвилин у 1%-ний розчин барвника амідочорного у семипроцентній оцтовій кислоті. Барвник зливають, промивають гель водопровідною водою. Гелеві стовпчики вкладають у канавки касети камери для знебарвлювання, встановлюють касету у ванні, вносять туди 7%-ний розчин оцтової кислоти так, щоб рівень розчину був на 5-7 мм вищим за верхній рівень гелевих стовпчиків у касеті. Підключають камеру до блоку живлення. Через 0-20 хвилин після очищення геелвих стовпчиків від вільного барвника їх виймають із касети. Зберігати гелеві стовпчики можна в пробірках з 7%-ним розчином оцтової кислоти протягом тривалого часу.

Проводять оцінку електрофореграми, відзначаючи виявлені фракції білків.