2.3.3.6. Анализ β-глобинового гена и обобщение опыта исследования одного гена.

β-глобиновый ген. Разд. 2.3.2.1 начинался с анализа структуры β-глобинового гена, которая была раскрыта благодаря использованию новых методов и подходов. Наиболее важные из них описаны в предыдущем разделе, однако теперь мы снова вернемся к анализу данного гена.

Как уже говорилось, первым этапом является идентификация этого гена в необозримом «море» человеческой ДНК. Для этого ее выделяют из клеток, затем рестрицируют. Образовавшиеся фрагменты разделяют по длине с помощью агарозного гель-электрофореза. Фракционированные фрагменты денатурируют и переносят на нитроцеллюлозные фильтры методом блотинга (промакивания) по Саузерну, в результате чего на фильтре ДНК представлена уже в одноцепочечной форме и фиксирована. Следующий шаг состоит в идентификации фрагмента ДНК, содержащего β-глобиновый ген. Для этого необходим радиоактивный ДНК-зонд, который синтезируется на β-глобиновой мРНК с помощью обратной транскриптазы (мРНК → кДНК). Этот кДНК-зонд можно использовать теперь для гибридизации с геномной ДНК прямо на фильтре. Радиоавтография позволяет обнаружить фрагменты, содержащие глобиновый ген.

Данный метод пригоден и для локализации β-глобинового гена с помощью гибридизации in situ, как описано в разд. 2.3.2.3 на примере гена тяжелой цепи миозина. Ген Нbβ был локализован таким способом в коротком плече хромосомы 11 (Пр; см. разд. 4.3). Для более подробной характеристики β-глобинового гена необходимо получить большое количество его ДНК, что достигается с помощью клонирования кДНК в каком-нибудь векторе, например в

134 2. Хромосомы человека

бактериальной плазмиде (см. разд. 2.3.2.2). Анализ семейства β-глобиновых генов проводили, сравнивая последовательности геномной ДНК в транскрибируемой области с кДНК методами электронной микроскопии; по данным секвенирования геномной ДНК внутри и вне транскрибируемых последовательностей; с помощью идентификации сигнальных последовательностей. Первый и наиболее впечатляющий результат состоял в обнаружении с помощью электронной микроскопии того факта, что геномная β-глобиновая ДНК и кДНК не совпадают по длине и при гибридизации образуют характерные петли [1329]. Последние формируются за счет тех участков геномной ДНК, которые отсутствуют в кДНК и, следовательно, не транскрибируются, поскольку кДНК является точной копией мРНК. В гене Нbβ были выявлены две такие вставочные последовательности (интроны), которые разделяют три разные кодирующие области (экзоны). Исследования, проведенные на многих других эукариотических генах, показали, что наличие интронов является скорее правилом, чем исключением. Этим гены эукариот существенно отличаются от бактериальных и вирусных генов, у которых транскрипция по всей длине одного гена не прерывается. Часто экзоны представляют собой функциональные субъединицы гена. Они могут возникать в ходе эволюции (разд. 7.2.3) как результат объединения нескольких самостоятельных генов.

Эти и более поздние исследования подтвердили выводы, сделанные на основании семейных данных об аномальных гемоглобинах (разд. 4.3.2), согласно которым имеется только один функциональный ген Нbβ, тогда как, например, гены α и γ-глобинов дуплицированы. Однако молекулярные исследования позволили выявить еще и псевдогены, они сходны с последовательностями ДНК функциональных генов, но не транскрибируются вследствие мутаций в кодирующих или фланкирующих участках. На рис. 4.44 показана область Нbβ. Кроме этого гена и его псевдогена имеются два γ-гена, один δ-ген (для δ-полипептидной цепи, входящей в состав НbА₂) и гены ранних эмбриональных глобинов. Молекулярный анализ подтвердил выводы относительно структуры этой генной области, полученные на основании формально-генетического анализа и биохимии гемоглобинов (разд. 4.3), но одновременно дал много совершенно новой информации о структуре и функциональной организации эукариотических генов как таковых.

Специальные исследования помогли ответить и на вопрос о том, как происходит транскрипция и как образуется зрелая мРНК (рис. 2.90). Выяснилось, что сначала транскрибируется весь ген, включая интроны и фланкирующие последовательности, расположенные дистальнее кодирующей области. Затем участки транскрипта, соответствующие интронам, вырезаются, 5'-конец «кэпируется» (блокируется 5-метилцитозином), а 3'-конец защищается poly А-последовательностью. Наконец, мРНК, претерпевшая такой процессинг (созревание), покидает ядро, переходит в рибосомы и используется как матрица для биосинтеза белка. Сейчас известны последовательности ДНК различных глобиновых генов. Изучение этих генов позволило решить много общих проблем, касающихся организации и экспрессии генетического материала в клетке. Вопросы, связанные с полиморфизмом глобиновых генов на генетическом, клиническом, белковом уровнях и на уровне ДНК, рассматриваются в разд. 4.3. Ряд аспектов мутационного про-

Рис. 2.90. Единичная нуклеотидная цепь ДНК с характерной специфической последовательностью оснований. На 5'-конце, где начинается транскрипция, обозначены два характерных участка: СААТ и ТАТА (80 и 30 п. н.). По аналогии с бактериальным геномом предполагают, что последовательность СААТ служит сайтом узнавания для РНК-полимеразы, а участок ТАТА является промоторным для индуцируемой полимеразой транскрипции. ДНК транскрибируется в комплементарную последовательность РНК, включая интроны. Затем РНК подвергается процессингу, интроны удаляются, 5'-конец «кэпируется», а 3'-конец закрывается последовательностью poly А. После этого созревшая мРНК проходит через ядерную мембрану и прикрепляется к рибосоме, где генетическая информация транслируется в белковую последовательность.

2. Хромосомы человека 135

цесса будет обсуждаться в разд. 5.1.4.3, а эволюционные аспекты-в разд. 7.2.3.