2.3.3.4. Секвенирование днк [117; 122; 381]

Последовательность нуклеотидов и генетический код. Методы определения последовательности аминокислот в полипептидной цепи были известны еще в 50-х гг. Теоретически это относительно легкая проблема, поскольку все 20 аминокислот, встречающиеся в природных белках, имеют разные свойства. С другой стороны, нуклеотидная последовательность ДНК относительно однородна по составу элементарных звеньев, так как содержит только четыре типа азотистых оснований-гуанин, цитозин, аденин и тимин. Когда еще в 60-х г. был расшифрован генетический код, появилась возможность восстанавливать (дедуцировать) нуклеотидную последовательность транскрибируемой ДНК по аминокислотной последовательности соответствующего белка. Однако генетический код является вырожденным, то есть одной и той же аминокислоте соответствуют несколько разных нуклеотидных триплетов. Следовательно, суждения о нуклеотидной последовательности, основанные на последовательности аминокислот в белке, не однозначны. Кроме того, последовательности аминокислот не содержат никакой информации о последовательности некодирующих участков ДНК. В настоящее время разработаны методы непосредственного секвенирования ДНК [117]. Принцип состоит в следующем: длинную молекулу ДНК фрагментируют при помощи агентов, расщепляющих ее в специфических сайтах. Затем определяют последовательность нуклеотидов в каждом из этих фрагментов. Очередность фрагментов в целой молекуле восстанавливают, используя перекрывающиеся концы: идентичные цепи разрезают повторно другой рестриктазой, а затем последовательности перекрывающихся фрагментов, образующихся при обработке двумя рестриктазами разной специфичности, сравнивают. Так может быть реконструирована полная последовательность. В пределах отдельных фрагментов порядок нуклеотидов определяют с помощью специальных методов. Раньше секвенирование ДНК было весьма трудным делом, теперь же оно осуществляется довольно легко и быстро. Для этого необходимо длинную молекулу ДНК с помощью рестриктазы разделить на фрагменты удобного размера, а затем, если нужно, размножить их путем клонирования (разд. 2.3.2.2). В настоящее время секвенируют очень длинные молекулы ДНК. Например, определены уже последовательности всей митохондриальной ДНК человека (разд. 2.3.5) и семейства )3-глобиновых генов (разд. 4.3). С помощью секвенирования ДНК можно получить более точные сведения и о нетранскрибируемых участках ДНК, важных для контроля транскрипции (так называемые операторы и промоторы).

2.3.3.5. Сортировка хромосом при помощи цитофлуорометрии

Зачем нужны сортировка хромосом и препараты отдельных хромосом? Сортировка хромосом методом цитофлуорометрии используется в двух разных целях: 1) для идентификации и количественного анализа рисунка флуоресценции большого числа хромосом в течение очень короткого времени; 2) для препаративного разделения хромосом. Этот метод имеет два преимущества перед стандартными методами анализа хромосом: он автоматический, благодаря чему исключается элемент субъективности, и он намного быстрее. Например, некоторые хромосомные аберрации настолько малы, что их невозможно обнаружить обычными методами, но при определенных условиях они идентифицируются с помощью цитофлуорометрии.

Однако важнее, что этот метод позволяет препаративно разделять хромосомы, и при наличии специфических зондов исследовать структуру и функцию отдельных генов становится относительно просто. В этом случае ген можно локализовать в хромосоме с помощью гибридизации in situ, размножить его ДНК путем клонирования и секвенировать. Можно исследовать таким же образом и генетический материал некодирующих участков гена. Основой для такого рода исследований являются геномные библиотеки ДНК. Однако их неудобство состоит в том, что обычно трудно или невозможно отобрать из огромного количества фрагментов интересующие нас последовательности. Кроме того, изучение распределения ДНК по различным хромосомам нередко само по себе является важным предметом исследования. Для такого рода работ необходимы библиотеки ДНК отдельных хромосом или даже их отдельных фрагментов.

132 2. Хромосомы человека

Рис. 2.88. Принцип сортировки хромосом с помощью лазера. Хромосомы окрашены флуоресцирующим красителем. Флуоресценция возбуждается лазерным лучом и измеряется для каждой хромосомы отдельно. Данные измерений используют для сортировки хромосом. (Courtesy of Dr.C. Gremer.)

Физический принцип [364] становится ясен из рис. 2.88. На нем изображена однолучевая система, но используют также и двулучевые системы, в которых применяются два разных пучка света. Для анализа с помощью двулучевой системы хромосомы окрашивают двумя красителями с максимумом флуоресценции при разных длинах волн. Затем митотические хромосомы отделяют от остального клеточного материала и помещают в систему. Их «прогоняют» одну за другой через заполненную водой измерительную часть устройства, где они последовательно освещаются двумя лазерными пучками (например, одним ультрафиолетовым, а другим - видимым светом с длиной волны 459 нм). Два типа флуоресценции, возникающей в точке пересечения потока хромосом и лазерного пучка, собираются линзой и проецируются на отдельные фотоумножители, благодаря чему можно построить двумерное изображение (рис. 2.89) по двум одномерным для каждого красителя и длины волны. В опыте, представленном на рис. 2.89, были подобраны два таких красителя: один из них окрашивал районы, представленные в основном А—Т-парами, а другой - районы с преимущественным содержанием G—С-пар. Система может включать приспособление, которое позволяет менять направление потока хромосом в зависимости от рисунка флуоресценции. С помощью такого метода получают относительно чистые препараты отдельных групп морфологически сходных хромосом и даже отдельных хромосом.

Сортировка Х- и Y-хромосом. В работе [333, 330] осуществлена препаративная проточная цитофотометрия Х- и Y-хромосом человека. Х-хромосома была выделена из клеточной линии с кариотипом 48,ХХХХ с помощью однолучевой сортировки. Этот материал был использован для приготовления библиотеки хромосомной ДНК после обработки рестриктазой EcoRl и клонирования в фаге X, (см. разд. 2.3.2.2). Y-хромосома отобрана с помощью двулучевого сортера из материала гибридной клеточной линии «китайский хомячок х человек». Получение клеточных гибридов будет описано в разд. 3.4.3 в связи с локализацией генов в хромосомах. Важная особенность гибридных клеток человек х мышь или

2. Хромосомы человека 133

человек х хомячок состоит в том, что при их размножении утрачиваются преимущественно хромосомы человека. Таким путем была получена клеточная линия, которая имела полный набор хромосом хомячка и только У-хромосому человека. Поскольку все хромосомы хомячка отличаются от хромосомы человека в большей степени, чем сами хромосомы человека между собой, такие клеточные гибриды особенно под-

Рис. 2.89. Контурный график (интенсивность флуоресценции) двумерной лазерной сортировки хромосом из гибридных клеток «китайский хомячок х человек», в которых осталась только человеческая У-хромосома. Буквы А-К относятся к разным хромосомам хомячка; буква L указывает на Y-хромосому человека. А. Все хромосомы; Б. Только маленькие хромосомы. (По [330].)

ходят для сортировки. На рис. 2.89 показаны пики на двумерной картине: хромосома, помеченная буквой L-это Y-хромосома человека. Она отделена от остальных настолько четко, что из этого материала можно получить библиотеку ДНК этой хромосомы.