2.3.3.3. Гибридизация нуклеиновых кислот

Принцип. В разд. 2.3.1.1 мы уже упоминали метод идентификации ДНК-повторов, основанный на разделении двойных цепей при повышении температуры и их реассоциации при быстром снижении температуры. Таким образом, в этом методе используется способность комплементарных цепей нуклеиновых кислот гибридизоваться одна с другой и образовывать двойную спираль. То же свойство используется для идентификации разделенных гель-электрофорезом фрагментов ДНК в методе Саузерна (Southern blotting, разд. 2.3.2.2). Способность к гибридизации цепей ДНК лежит в основе многих методических приемов молекулярной биологии, поэтому более подробное описание принципа гибридизации будет полезным. Большинство природных ДНК встречается в виде двухцепочечных молекул. Их устойчивость поддерживается благодаря тому, что пиримидиновое основание цитозин (С) спаривается с пуриновым основанием гуанином (G), в то время как пиримидиновое основание тимин (Т) спаривается с пуриновым основанием аденином (А). Эти комплементарные пары оснований удерживаются водородными связями (тремя в паре G-C и двумя в паре А-Т), которые относительно легко разрываются, но и быстро восстанавливаются, при этом одноцепочечные фрагменты ДНК, присутствующие в растворе, снова формируют двойную спираль. Для реассоциации не имеет значения происхождение одноцепочечной ДНК, не требуется даже полной комплементарности отдельных цепей. Реассоциация происходит даже тогда, когда какая-то часть оснований в каждой цепи не комплементарна (рис. 2.85). Одноцепочечная ДНК может спариваться (гибридизоваться) даже с РНК, если у них есть комплементарные основания.

«Прогулка по хромосоме». Метод гибридизации полезно использовать, например, для анализа очень протяженного гена. При этом с помощью подходящего зонда из геномной библиотеки ДНК извлекается первоначально какая-то часть такого гена. Нуклеотидная последовательность этой части гена будет, как правило, длиннее зонда, и ее концы будут перекрываться с другими фрагментами данного гена в этой библиотеке, т. е. будут по крайней мере частично гибридизоваться с ними. Свободные концы этих фрагментов будут гибридизоваться со следующими и т.д., пока весь структурный ген не будет полностью идентифицирован серией перекрываю-

128 2. Хромосомы человека

Рис. 2.85. Принцип ДНК- или РНК-гибридизации. А. Нуклеотидные цепи в растворе. Б. Гибридизация цепей в соответствии с правилами спаривания: тимин образует пару с аденином, цитозин с гуанином. В. Гибридизация может происходить даже при неполной гомологии, важно, чтобы различия не были слишком велики.

щихея фрагментов. Именно таким образом был реконструирован структурный ген фактора свертывания крови VIII человека, необычно длинный, состоящий из 180000 пар нуклеотидов. Реконструкцию начинали с олигонуклеотидного зонда длиной всего в 36 нуклеотидов. Описанный ранее метод, когда сначала выделяется специфическая мРНК, а затем с помощью обратной транскрип газы на ней синтезируется кДНК, в данном случае оказался непригоден из-за низкой концентрации мРНК. Олигонуклеотидный зонд был синтезирован на основе аминокислотной последовательности фрагмента белка фактора VIII, и ее комплементарность оказалась достаточной для эффективной гибридизации. Полный анализ гена фактора VIII описан в разд. 2.3.7.

Гибридизация in situ. Метод гибридизации in situ особенно удобен для анализа эукариотических геномов методами молекулярной цитогенетики. Препарат метафазных хромосом обрабатывают радиоактивным ДНК-зондом в условиях, позволяющих этому зонду гибридизоваться с хромосомной ДНК. Таким образом исследуемый ген можно локализовать в специфическом хромосомном сегменте. На первых этапах применение этого метода ограничивалось идентификацией в хромосомах только высокоповторяющихся нуклеотидных последовательностей, в частности сателлитной ДНК. Но даже только эти данные позволили сделать важные выводы относительно эволюции человека (разд. 7.2.2). Позже метод гибридизации in situ был усовершенствован настолько, что теперь с его помощью можно локализовать в хромосомах даже уникальные гены, такие, например, как ген

Рис. 2.86. Гибридизация in situ гена тяжелой цепи миозина. Фотография в фазовом контрасте метафазы после гибридизации с 3Н-меченным кДНК-зондом и экспонирования в радиоавтографической эмульсии в течение 20 дней. Стрелка указывает на зерно серебра в теломерном участке короткого плеча хромосомы 17.(По [482].)

Рис. 2.87. Распределение зерен серебра в 36 метафазах после гибридизации с кДНК-зондом тяжелой цепи миозина. Гистограмма построена по результатам анализа, основанного на разделении гаплоидного кариотипа человека на ПО равных отрезков (хромосомы изображены как одна квазинепрерывная последовательность). Число меченых участков указано для каждого сегмента. Обнаружен кластер зерен в коротком плече хромосомы 17. (По [482].)

130 2. Хромосомы человека

Таблица 2.14. Некоторые гены человека, идентифицированные с помощью гибридизации
Ген, длина последовательности ДНК и число копий	Локализация
β-глобин (4400 п. н.)	11р
α-глобин (800 п. н.)	16р
Инсулин (900 п.н.)	11р15
LGH (550 п. н.)	17q22-24
Генный кластер плацентарного лактогенного гормона роста
Интерферон	9p2,l-pter
IFN α + β, IFNγ	12q24,l
Онкоген с-myc (2750 п.н.)	8q24
Онкоген c-mos (2750 п.н.)	8q22
Ig (6600 п.н.)	14q32
Гены тяжелых цепей (у4) (много)
Ig Каппа (10500 п.н.)	2pl2
Гены легких цепей (VK) (50)
Онкоген myb (2000 п.н.)	6q22-24
Онкоген fes (4000 п. н.)	15q24-gter
α-фетопротеин (380 п.н.)	4qll-22
Сывороточный альбумин (1600 п.н.)	4qll-22
Онкоген с-myc (-)	8q
Онкоген с-аbl (1100 + 600 п.н.)	9q3,4
RFLP (ПДРФ) (500 н. н.)	14q31,2-3,2
Dl4S1
IgC лямбда (203 п. н.) (семейство генов)	22qll
Онкоген N-ras (4000 п.н.)	1cen-p21
Миозин МНС (2200 п. н.)	17pl,2-pter
(?)
Коллаген (COL 1A2)	7q22
(?)
Онкоген ras (mil) (2500 п. н.)	3p25
(?)

инсулина ([377] гл. 3). Для этого используют статистический анализ распределения радиоактивной метки по длине отдельных хромосом во многих метафазных препаратах.

В качестве примера рассмотрим теперь основные этапы анализа гена тяжелой цепи миозина [482]. Вначале был получен кДНК-зонд для гена тяжелой цепи миозина кролика. Поскольку гомологичные гены различных млекопитающих в общем сходны, их гибридизация проходит без затруднений. Зонд клонировали в плазмиде и выделенную затем ДНК метили тритием (³Н) с помощью ник-трансляции (nick translation). Для этого ДНК инкубировали с небольшим количеством ДНКазы-1, которая вносит несколько одноцепочечных разрывов в двухцепочечную ДНК. Затем добавляли радиоактивно меченные нуклеотиды и ДНК-полимеразу, при этом меченые нуклеотиды встраивались в ДНКзонд.

Препараты митотических хромосом получали из культуры лимфоцитов, подвергали специальной обработке с целью денатурации хромосомной ДНК и затем проводили гибридизацию с меченным тритием ДНК-зондом в течение 16-18 ч при 40°С.

После отмывания препаратов с целью удаления несвязавшейся или неспецифически адсорбированной ДНК их экспонировали в течение 3 недель для получения радиоавтографов. После окрашивания акрихинипритом (Q-метод) препараты сфотографировали. На рис. 2.86 показана типичная метафазная пластинка, а на рис. 2.87-распределение метки по отдельным сегментам всех хромосом человека. Как видно, основная масса метки обнаруживается на коротком плече хромосомы 17 в сегменте 17pl.2  pter. На основании этого был сделан вывод, что ген тяжелой цепи миозина расположен в хромосоме 17. Поскольку данный эксперимент был проведен с зондом кДНК, мы не вправе утверждать, что идентифицированный миозиновый ген является действительно активным. Он может быть и «псевдогеном», т.е. такой последовательностью ДНК, которая структурно гомологична активному гену миозина, но сама не транскрибируется, т. е. не детерминирует синтез миозина, поскольку лишена каких-то важных фланкирующих последовательностей вне транскрибируемой части. Такие псевдогены были обнаружены, например, в пределах кластеров α- и β-глобиновых генов (разд. 4.3). Все большее число генов человека успешно локализуется в хромосомах с помощью этого метода (разд. 3.4, табл. 2.14)

2. Хромосомы человека 131