Самостійна позааудиторна робота:

1. Скласти схему шляхів утворення і використання амінокислот.

2. Написати рівняння глутаматдегідрогеназної реакції, пояснити її значення в обміні амінокислот.

3. Написати рівняння реакції трансамінування між аланіном і α-кетоглутаратом, аспартатом і α-кетоглутаратом, назвати ферменти, кофермент.

4. Підготувати вихідні дані для оформлення протоколу лабораторної роботи.

Контрольні питання:

1. Шляхи перетворень амінокислот після всмоктування.

2. Дезамінування амінокислот.

3. Трансамінування амінокислот, характеристика ферментів і коферментів.

4. Синтез замінимих амінокислот.

5. Декарбоксилювання амінокислот, біогенні аміни, та їх інактивація.

6. Визначення активності АЛТ і АСТ (принцип методу, хід роботи і клініко-діагностичне значення).

7. Фармпрепарати – амінокислоти, біогенні аміни, антигістамінні і антисеротонінові, інгібітори амінооксидаз.

Самостійна робота на занятті:

Виконати лабораторну роботу, оформити та захистити протокол.

1. Визначення активності АлАТ і АсАТ.

Трансамінази або амінотрансферази - ферменти, які каталізують зворотнє перенесення аміногруп між аміно- і кетокислотами. В ролі коферменту в амінотрансферазах виступає піридоксальфосфат (похідне вітаміну В6).

Принцип методу. В результаті переамінування під дією аспартатамінотрансферази (АсАТ) аспарагінова кислота перетворюється в щавелевооцтову (ЩОК), а аланін під дією аланінамінотрансферази (АлАТ) - в піровиноградну кислоту (ПВК). ЩОК здатна в процесі ферментативної реакції перетворюватися в ПВК. При додаванні кислого 2,4-динітрофенілгідразину (2,4-ДФГ) ферментативний процес зупиняється і утворюється динітрофенілгідразин піровиноградної кислоти, який в лужному середовищі дає коричнево-червоне забарвлення, інтенсивність якого пропорційна кількості утвореної ПВК. Таким чином, по кількості утвореної ПВК можна судити про активність ферменту. Активність амінотрансфераз виражають в мікромолях ПВК, утвореної 1 мл сироватки крові за 1 годину інкубації при температурі 37^оС. В нормі активність АсАТ сироватки крові становить 0,1-0,45 мкмоль/год х мл, а АлАТ - 0,1-0,68 мкмоль/год х мл.

1.1. Визначення активності аспартатамінотрансферази

Хід роботи. В дві пробірки (дослідну і контрольну) вносять по 0,5 мл субстратної суміші для визначення АсАТ і ставлять в термостат при 37^оС на 5 хвилин. Потім в дослідну пробірку додають 0,1 мл сироватки крові, а в контрольну - 0,1 мл води і 0,5 мл розчину 2,4-ДФГ. Ставлять обидві пробірки в термостат на 60 хвилин при температурі 37^оС. Виймають пробірки, додають в дослідну пробу 0,5 мл розчину 2,4-ДФГ і залишають при кімнатній температурі на 20 хвилин. Далі додають по 5 мл 0,4н розчину NаОН в кожну пробірку, ретельно перемішують і залишають при кімнатній температурі на 10 хв. для розвитку забарвлення. Оптичну густину вимірюють на ФЕКу в кюветі на 10 мм при зеленому світлофільтрі (500-560 нм) проти контролю. Розрахунок активності ферменту виконують по приготовленому заздалегідь калібрувальному графіку (за допомогою стандартного розчину ПВК). Активність виражають в умовних одиницях з розрахунук на 1 мл сироватки. 1 одиниця АсАТ відповідає такій активності ферменту, яка здатна за даних умов утворювати 1 мкг ПВК. При обчисленні ферменту необхідно врахувати і розведення сироватки:

Х = А х 10;

де Х – одиниця активності ферменту;

10 – перерахунок на 1 мл;

А - кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг.

В сироватці крові здорових людей активність АсАТ, визначена при допомозі даного методу, коливається від 8 до 40 од. Перерахунок активності ферменту в мікромолі ПВК, що утворилася при інкубації 1 мл сироватки на протязі 1 години при 37^оС, проводять за формулою:

А х 10

АсАТ = --------- ,

88

де А – кількість ПВК в 0,1 мл сироватки, знайдена по калібрувальному графіку, мкг;

88 - маса 1 мкм ПВК, мкг;

10 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки.