МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ»

Кафедра паразитологии, микробиологии,

эпизоотологии, зоогигиены и ветсанэкспертизы

СД. 07 МИКРОБИОЛОГИЯ МОЛОКА И МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ

Лабораторная работа.

Биологические свойства молочнокислых бактерий, бифидобактерий,

пропионовокислых бактерий, уксуснокислых бактерий и дрожжей

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Специальность

260303 Технология молока и молочных продуктов

Уфа 2010

У ДК 637.12:378.147

ББК 36.95+74.58

М 54

Рекомендовано к изданию методической комиссией факультета ветеринарной медицины (протокол № ___ от «___» __________ 200__ г.)

Составители: профессор, д-р биол. наук Андреева А. В.

ассистент, канд. биол. наук Николаева О. Н.

Рецензент: зав. кафедрой технологии молока и мяса, д-р с.-х. наук, профессор Тагиров Х. Х.

Ответственный за выпуск: зав. кафедрой паразитологии, микробиологии, эпизоотологии, зоогигиены и ветсанэкспертизы, д-р биол. наук, проф. Андреева А. В.

г . Уфа, БГАУ, кафедра паразитологии, микробиологии и вирусологии

Лабораторная работа № 2 Биологические свойства молочнокислых бактерий, бифидобактерий, пропионовокислых бактерий, уксуснокислых бактерий и дрожжей

Цель занятия:

1. Изучить биологические свойства молочнокислых бактерий, бифидобактерий, пропионовокислых бактерий, уксуснокислых бактерий и дрожжей.

2. Изучить питательные среды, используемые для культивирования молочнокислых бактерий, бифидобактерий и дрожжей.

3. Изучить методы определения молочнокислых бактерий, бифидобактерий, и дрожжей в молоке и молочных продуктах.

Оборудование и материалы. Плакаты, слайды, микропрепараты молочнокислых бактерий, бифидобактерий, пропионовокислых, уксуснокислых бактерий и дрожжей.

Пробы сметаны, кефира и творога; предметные стекла, раствор метиленовой сини, набор красок по Грамму, спиртовки, бактериальные петли и пипетки, карандаши по стеклу, спирт.

1. Общие сведения.

1.1 Биологические свойства молочнокислых бактерий, бифидобактерий, пропионовокислых бактерий, уксуснокислых бактерий и дрожжей

1.1.1 Молочнокислые бактерии – специфическая группа микроорганизмов, которая обуславливает молочнокислое брожение.

В природе молочнокислые бактерии представлены в виде шаровидных (кокков) и палочковидных (лактобактерий) форм.

Семейство Streptococcaceae (молочнокислые стрептококки, шаровидные молочнокислые бактерии) представлено тремя родами:

1 Род Lactococcus;

2 Род Leuconostoc;

3 Род Streptococcus.

Род Lactococcus включает пять видов. В молочной промышленности значение имеет вид Lactococcus lactis (молочный лактококк) и его два подвида: 1) Lact. lactis (молочный лактококк) (Lact. lactis subspecies lactis), а также его ароматизирующий биовар Lac. diacetilactis и 2) Lact. cremoris (сливочный лактококк) (Lact. lactis subspecies cremoris).

Морфология. Сферические или овальные клетки, располагающиеся короткими цепочками или попарно (рисунок 1).

Неподвижны, спор и капсул не образуют, по Грамму красятся положительно.

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы, мезофиллы (оптимальная температура роста 30-35°С).

На обычных питательных средах не растут. Требовательны к ростовым веществам. Культивируют на гидролизованном молоке, агаре с гидролизованным молоком и мелом, агаре с гидролизованном молоком (без мела), стерильном обезжиренном молоке.

Рисунок 1 Лактококки: а - Lac. Lactis; б – Lac. cremoris; в – Lac. diacetylactis

При развитии лактококков в молоке они вызывают образование ровного, без обильного отделения сыворотки плотного сгустка, имеющий приятный кисломолочный вкус и запах. Ароматобразующий лактококк образует сгусток с небольшим количеством углекислого газа. При росте на гидролизованном молоке вызывают помутнение среды. На агаре с гидролизованным молоком образуют мелкие каплевидные колонии с ровным краем и зонами простветления мела.

Растут в средах с низким значением рН от 5,5 до 8,8. спиртоустойчивы.

Биохимические свойства изучают по энергии кислотообразования, предельной кислотности, способности ферментировать соли лимонной кислоты, по качеству сгустка и т.д.

Lac. lactis - активный кислотообразователь, свертывает молоко за 4-7 часов, предельная кислотность 120°Т. восстанавливает и свертывает лакмусовое молоко, не образует ацетоина. Не развивается в щелочной среде. Ферментирует глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, декстрин.

Lac. cremoris не сбраживает мальтозу и декстрин, предельная кислотность 110-115°Т, энергия кислотообразования достигает 6-8 часов.

Lac. diacetilactis расщепляет цитраты сообразованием диоксида углерода и ацетоина и диацетила. Восстанавливает и свертывает лакмусовое молоко. Слабый кислотообразователь (более 16 часов), предельная кислотность 70-100°Т.

Род Leuconostoc объединяет видов. В молочной промышленности имеет значение вид Leuconostoc mesenteroides, который включает три подвида: Leu. cremoris, Leu. dextranicum, Leu.mesenteroides.

Морфология. Сферические, несколько вытянутые клетки, располагаются парами или цепочками. По Грамму красятся положительно, неподвижные, спор не образуют.

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. Растут на специальных питательных средах, требовательны к составу питательных сред. На плотных средах образуют мелкие, гладкие, круглые, серовато-белые колони. Бульонные культуры имеют однородное помутнение.

Биохимические свойства. Ферментирую глюкозу с образованием кислоты и газа, а также этанола и ароматических веществ (диацетила, ацетоина). Слабые кислотообразоваетели (свертывают молоко через 2-3 суток), часто не свертывают, протеолитической активностью не обладают. Усваивают цитраты с образованием ароматических веществ. Оболадают липолитической активностью.

Рисунок 2 Leuconostoc mesenteroides: а – круглые плотные колонии;

б - кокковая форма, круглые клетки, окруженные слизью

В род Streptococcus входит один вид молочнокислых кокков Streptococcus termophilus (термофильный стрептококк).

Морфология. Грамположительные шарообразные или эллипсовидные клетки, чаще располагающиеся длинными цепочками. По величине клетки крупнее, чем у молочного стрептококка. Спор и капсул не образует, неподвижен (рисунок 3).

Рисунок 3 Streptococcus termophilus

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. На поверхности питательных сред образует мелкие колонии округлой формы с зернистой структурой и локонобразными краями, глубинные колонии имеют чечевицеобразную форму с боковыми вырастами. Оптимальная температура роста 37-40°С.

Биохимические свойства. По энергии кислотообразования превосходит лактококков. Предельная кислотность 110-115°С (энергия кислотообразования - 3,5-6 ч). Ферментирует только лактозу, глюкозу и сахарозу.

Некоторые штаммы образуют диацетил и ацетоин (факультативные гетероферментативный). Лакмусовое молоко не восстанавливает, чувсвтителен к действию специфических бактериофагов.

К семейству Lactobacteriaceae (молочнокислые палочки) относится род Lactobacterium, который включает три подрода:

1. Thermobacterium (термобактерии, Lbm. helveticum (швейцарская палочка), Lbm. delbrueski subsp. bulgaricum (болгарская палочка) Lbm. acidophilum (ацидофильная палочка), Lbm. delbrueski subsp. lactis (молочная палочка)) – Облигатные гомоферментативные молочнокислые палочки, которые ферментируют углеводы исключительно до молочной кислоты.

2. Streptobacterium (стрептобактерии, Lbm. plantarum, Lbm. casei subsp. rhamnosus.) - факультативные гетероферментативные бактерии, которые могут ферментировать углеводы до молочной кислоты или до молочной, уксусной, муравьиной кислот и других продуктов.

3. Betаbacterium (бетабактерии, Lbm. brevis, Lbm. buchneri, Lbm. bifermentans) - Облигатные гетероферментативные палочки, которые ферментируют углеводы до молочной и уксусной кислот, этанола и СО₂.

Морфология. Лактобактерии представляют собой палочки, встречаются изогнутые и булавовидные формы. Неподвижны, спор и капсул не образуют, по Грамму красятся положительно. Некоторые стрепто- и бетабактерии подвижные перитрихи.

У термобактерий клетки имеют вид крупных (иногда зернистых) палочек, располагающихся в виде одиночных или цепочек (рисунок 4).

Рисунок 4 Термофильные молочнокислые палочки: а – болгарская палочка;

б – сырная палочка; в – ацидофильная палочка

Стрептобактерии образуют в молоке короткие цепочки (рисунок 5).

Рисунок 5 Стрептобактерии: а – Lbm. casei; б – Lbm. plantarum

Клетки бетабактерий крупные, иногда зернистые (рисунок 6).

Рисунок 6 Бетабактерии: а – клетки; б - колонии

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы.

Стрептобактерии и бетабактерии – мезофилы (оптимальная температура роста 30°С), термобактерии – термофилы (оптимальная температура роста 40°С).

Оптимальная рН 5,5-6,2. Очень требовательны к питательным средам, на обычных питательных средах не растут, выращивают на средах с молоком. При развитии в молоке вызывают образование однородного плотного сгустка с приятным кисломолочным запахом и вкусом. При росте в жидких средах (гидролизованное молоко) наблюдается помутнение среды. На плотных питательных средах (агар с гидролизованным молком и мелом, МРС-агар, селективная среда ЛС) лактобактерии формируют округлые, мелкие, гладкие, блестящие колонии серо-белого цвета. На гидролизованном агаре с мелом образуется зона проствеления, выделяют колонии R-формы и S-формы.

Биохимические свойства. Обладают хорошо выраженными сахаролитическими свойствами. Ферментируют глюкозу, галактозу, лактозу, мальтозу.

Обладают слабой протеолитической активностью.

Термобактерии являются активными кислотообразователями, сквашивают молоко через 4-5 часов, предельная кислотность 200-350°Т.

Стрептобактерии обладают менее выраженной кислотообразующей активностью. Ферментируют молоко через 2-3 сут, предельная кислотность 180°Т.

Бетабактерии обладают слабой энергией кислотообразования и молоко не сквашивают. В молоке образуют небольшое количество летучих кислот, углекислый газ, этиловый спирт, молочную кислоту.

1.1.2 Бифидобактерии – это облигатная и доминирующая часть кишечноймикрофлоры здорового человека и теплокровных животных.

Относятся к семейству Actinomycetaceae, роду Bifidobacterium (Bifidobacterium bifidum, B. breve, B. longum).

Морфология. Бифидобактерии представляют собой чрезвычайно вариабельные мелкие палочки – прямые, изогнутые, разветвленные, раздвоенные V- или Y-формы, булавовидные, лопатовидные. Грамположительные, спор и капсул не образуют. Ветвление происходит в среде неполноценной по источникам питания (рисунок 7).

Культуральные свойства. Строгие анаэробы. Нуждаются в огромных количествах факторов роста.

Рисунок 7 Бифидобактерии

Культивируют на молоке, гидролизованном молоке, гидролизате казеина, на печеночно-цистеиновой среде (среда Блаурокка), годролизатно-молочной среде (ГМ-среда). На плотных питательных средах образуют колонии плоские, блестящие, шероховатые и т.д. цвет колоний от белого до темно-коричневого.

Биохимические свойства. Активно сбраживают сахарозу, галактозу, мальтозу, лактозу. Большинство штаммов не сквашивают молоко или сквашивают его через 4 сут и более. Предельная кислотность 120-130°Т.

1.1.3 Пропионовокислые бактерии – являются возбудителем пропионовокислого брожения, при котором углеводы ферментируются до пропионовой кислоты и её солей – пропионатов.

Относятся к семейству Propionibacteriaceae, роду Propionibacterium, идентифицировано 8 видов, типовой из них Propionibacterium shermanii и Propionibacterium freidenreichii.

Морфология. Неподвижные, не образующие спор и капсул грамположительные полиморфные палочки. Располагаются одиночно, попарно, короткими цепочками, в виде букв V или Y или в виде китайских иероглифов (рисунок 8).

Рисунок 8 Пропионовокислые бактерии

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. Для роста необходим пантотенат кальция и биотин. Для выращивания используют трипсино-дрожжевой экстракт-глюкозную среду. Вызывают помутнение бульона с пептоном, дрожжевым экстрактом и глюкозой. На плотной среде кровяного агара образуют мелкие выпуклые полупрозрачные разного цвета колонии.

Мезофилы, оптимальная рН 7,0.

Биохимические свойства. Хемоорганотрофы. В молоке развиваются медленно и свертывают его через 5-7 дней, но предельная кислотность может достигать 160-170°С. Сбраживают углеводы, лактаты и пептон.

1.1.4 Уксуснокислые бактерии (ацетобактерии) – окисляют этиловый спирт в уксусную кислоту.

Относятся к семейству Pseudomonadaceae, роду Acetobacter, идентифицировано 11 видов, типовой - Acetobacter aceti.

Морфология. Мелкие, прямые или слегка изогнутые палочки. Подвижные грамотрицательные палочки, которые располагаются поодиночке, попарно, цепочками. Спор и капсул не образуют (рисунок 9).

Рисунок 9 Уксуснокислые бактерии: а – клетки; б - колонии

Культуральные свойства. Облигатные аэробы. Оптимальная температура роста 25-30°С, рН 4,5-6,3. Растут на простых и сложных питательных средах. На сусло-агаре образуют мелкие блестящие колонии, часто с пигментом желтого цвета.

На жидких подкисленных средах образуют слабую пленку. При посеве уколом в МПЖ дают гроздевидный рост.

Для дифференциации видов уксуснокислых бактерий применяют питательную среду ЖИК (GYC)

Биохимические свойства. Этанол и лактат служат хорошим источником углерода, манит усваивают плохо, лактозу, крахмал не гидролизуют , легко окисляют аминокислоты.

1.1.5 Дрожжи – это высшие грибы, утратившие способность образовывать мицелий и превратившиеся в одноклеточные организмы. ,Основные возбудители спиртового брожения.

Надцарство Eucaryotae

Царство Fungi (грибы)

Подцарство Mycobionta (высшие гибы)

Отдел Eumycota (истинные грибы)

Класс Ascomycetis (сумчатые грибы)

Семейство Endomycetaceae

Род Saccharomyces

Вид S. Lactis, S. casei

Род Zygosaccharomyces

Это немецилиальные одноклеточные грибы или дрожжи

(спорогенные)

Класс Deuteromycetes (несовершенные грибы)

Семейство Torulopsidaceae

Род Torulopsis, Candida, Mycoderma

Это немецилиальные одноклеточные грибы или дрожжи

(аспорогенные)

Морфология. Клетки овальные или слегка эллипсовидной формы, неподвижные, грамположительные, капсул не образуют (рисунок 10). Спорообразующие дрожжи образуют шаровидные гладкие овальные споры. Аспорогенные дрожжи существуют в дрожжевой (клеточной), реже – в мицелиальной (нитевидной) формах.

а	б		в		г
д	е	ж		з

Рисунок 10 Формы дрожжевых клеток: а - овальная яйцевидная;

б - цилиндрическая; в – апикулятная; лимоновидная; г – стреловидная;

д – треугольная; е – серповидная; ж – колбовидная; з, и - мицелевидная

Культуральные свойства. Факультативные анаэробы. Оптимальная температура развития 25-30°С, но многие могут размножаться и при минус 3°С. Большинство дрожжей предпочитают кислую среду обитания.

Для обнаружения дрожжей и плесеней используют специальные питательные среды: сусловый агар, среда Сабуро, среда с солодовым экстрактом, селективные среды с антибиотиками.

Дрожжи рода Candida на жидком сусле образуют пленку, кольцо или осадок. На сусло агаре формируют гладкие или складчатые колонии серого, белого или кремового цвета. Candida mycoderma на жидких средах образует плотную, толстую пленку, вползающую по стенке пробирки. На сусло-агаре этот вид образует плоские, матовые, гладкие, реже морщинистые колонии белого или желтовато-серого цвета.

Дрожжи рода Torulopsis образуют на плотных питательных средах очень мелкие колонии. Они гладкие, серо-желтого цвета с ровным краем.

Дрожжи рода Rhodotorula образуют каротиноидные пигменты, поэтому на плотных средах формируют гладкие, блестящие колонии желтого, оранжевого или красного цвета.

Биохимические свойства. Возможность дрожжей размножаться в молоке и молочных продуктах определяется их способностью сбраживать или окислять лактозу, а также наличием в молоке микрофлоры, обладающей -галактозидазной активностью. В связи с этим дрожжи, встречающиеся в молоке и молочных продуктах, делятся на 3 группы:

• Дрожжи, не спорообразующие, не ферментирующие лактозу (в молоке растут, но лактозу не сбраживают). К таким дрожжам относятся дрожжи родов Candida, Torula. Развиваются на поверхности молочных продуктов при хранении. Не способны к спиртовому брожению.

• Дрожжи, спорообразующие, не ферментирующие лактозу. Они ферментируют мальтозу с образованием газа, в производстве не применяются (дикие), развиваются с молочнокислыми бактериями (вид Saccharomyces cartilaginosus).

• Дрожжи, сбраживающие лактозу. Таких дрожжей не много. Наиболее часто в молочных продуктах встречаются следующие виды дрожжей этой группы: спорообразующие - Saccharomyces lactis, Saccharomyces fragilis, и неспорообразующие Torulopsis kefir, Torulopsis sphaerica, Candida pseudotropicalis и др.

Дрожжи, используемые в промышленности, называются культурными дрожжами. Некоторые спорогенные и аспорогенные дрожжи являются дикими дрожжами. Эти дрожжи так же, как и культурные, способны осуществлять спиртовое брожение, но помимо спирта образуют много побочных продуктов (таких как альдегиды, высшие спирты, эфиры и др.) и поэтому ухудшают органолептические показатели продукта. К дрожжам- вредителям производства относятся дрожжи родов Pichia, Hansenula, Candida, Rhodotorula, Torula, Torulopsis, Mycoderma, Trichosporon и др. Среди аспорогенных дрожжей встречаются ложные дрожжи, которые образуют псевдомицелий и растут на жидких субстратах в виде пленок.

1.1.6 Слизеобразующая палочка Brevibacterium linens – участвует наряду с пигментообразующими микрококками и дрожжами в образовании слизи на сыраз со слизевой поверхностью.

Относится к Семейству Brevibacteriaceae, роду Brevibacterium.

Морфология. Грамположительная палочка неправильной формы, располагается одиночно и попарно, спор не образует неподвижна.

Культуральные свойства. Облигатный анаэроб, оптимальная температура развития 20-35ºС, рН – 6,0-10,0. Рост на питательных средах простого состава. Вырабатывает красный пигмент, при инкубации на свету образует слизистые колонии различного цвета.

Биохимические свойства. Продуцирует протеолитические и липолитические ферменты, из глюкозы образует небольшое количество кислоты.