1. Провести забор смешанной слюны.

Собственно слюна собирается из протоков желез с помощью специальных капсул или путем канулирования слюнных протоков. Смешанная слюна собирается путем сплевывания или методом отсасывания шприцом со дна ротовой полости. При заборе слюны можно использовать стимуляторы слюноотделения (на кончик языка 1% р-р лимонной кислоты, жевание кусочка парофина, гальки). Стимулированная слюна по количеству и составу отличается от нестимулированной.

2. В пробе слюны определить содержание некоторых компонентов:

Определение рН слюны.

Используют стандартную универсальную индикаторную бумагу. Пользуясь цветной шкалой, определяют рН слюны. Сравнить с нормой. При отклонении рН от оптимального спрогнозировать степень резистентности к кариесу.

Биуретовая реакция. Качественная реакция на белки. Реакция обусловлена наличием в белке пептидных связей, которые в щелочной среде с сернокислой медью образуют окрашенные комплексы.

Ход работы: В пробирку внести 0,5-1,0 мл слюны, 1 мл 10% р-ра едкого натрия и 1-2 капли 1% р-ра сернокислой меди. Появляется фиолетовое окрашивание при наличии белков.

Реакция Фелинга на глюкозу.

Ход работы: К 10 каплям слюны прибавить 10 капель реактива Фелинга. Нагреть до кипения. При наличии глюкозы появляется красное окрашивание. Результаты сравнить с нормой. Обьяснить отсутствие глюкозы в собственно слюне.

Качественная реакция на кальций.

Ход работы:

Ход работы: В центрифужную пробирку внести 1мл 40% раствора щавелевокислого аммония, добавить 2 мл слюны. Через 30мин. Выпадает осадок щавелевокислого кальция.

Объяснить роль кальция в слюне.

Качественная реакция на фосфор.

Ход работы: К 2мл слюны добавить 1 мл молибденовокислого аммония. При наличии фосфора выпадает желтый осадок молибденофосфорного аммония.

Объяснить роль фосфатов в слюне.

Обнаружение каталазы. Фермент каталаза катализирует распад перекиси водорода с образованием кислорода и воды. На этом свойстве основано обнаружение фермента в биологических объектах.

Ход работы: К 0,5 – 1,0 мл слюны добавить равный объем 1% р-ра перекиси водорода, при наличии фермента наблюдается выделение пузырьков кислорода.

Объяснить роль каталазы в слюне.

Качественная реакция на роданиты слюны. Реакция основана на образовании в кислой среде роданистой соли железа –роданила – красного цвета. Роданиты слюны – соли и эфиры тиоциановой кислоты. Они являются продуктами обмена серусодержащих соединений. В норме в слюне содержится небольшое количество роданитов. У курильщиков содержание этих соединений увеличивается.

Ход работы: В пробирку внести 0,5 мл слюны, 5 капель раствора хлорного железа, 2-3 капли соляной кислоты. Появляется красное окрашивание, интенсивность которого зависит от содержания роданитов. Для сравнения проведите реакцию без слюны. Вместо слюны добавьте 7 капель роданистого аммония.

Объясните роль роданитов, возможные изменения состояния ротовой полости при их повышении.

Выполните следующие задания:

1. Исходя из положения, сформулированного в 90годы прошлого века, позволяющего представить слюну как структурированную систему, составьте определение понятия «слюна как биологическая жидкость».

2. В ночное время повышается вероятность возникновения кариесогенной ситуации. Почему?

3. Одним из важнейших защитных факторов слюны является фермент лизоцим. Содержание лизоцима в слюне повышается при остром течении патологических процессов, при хронизации процесса – снижается.

Каков механизм его антимикробного действия? Его источники?

4. Развитие бактериальной инфекции в ротовой полости во многом связано с способностью микроорганизмов к адгезии. Каков молекулярный механизм этого свойства? Какие факторы слюны способствуют потери бактериальной клетки адгезивной способности?

5. Назовите наиболее эффективные факторы слюны, выполняющие функцию противовирусной защиты. Охарактеризуйте молекулярные основы их антивирусного действия.

6. Ротовая полость – начальный отдел пищеварительного тракта, в котором происходит первый контакт организма с пищей и др. соединениями. Почему использование горячей пищи или воды не вызывает ожогов слизистой ротовой полости?

7. Назовите возможные причины снижения рН слюны (ниже рН 6). Почему в этой ситуации возникает кариесогенная ситуация?

8. Клиницистами отмечен антогонизм между кариесом и парадонтозом. Обоснуйте возможные причины этого феномена.

9. С чем связан тот факт, что содержание в слюне мочевины, креатина, кетоновых тел и некоторых других прямо коррелируется с содержанием в крови ( следовательно, их можно определять и в слюне в диагностических целях), а содержание глюкозы, аминокислот – нет.

10. Возможно биохимическое исследование слюны в диагностических целях. Назовите некоторые биохимические показатели слюны, характеризующие состояние тканей ротовой полости ( характерные признаки кариесрезистентности; воспаления парадонта). пародонта.

Занятие 35. Функциональная биохимия соединительной ткани.

Значение темы: Все ткани зуба, кроме эмали, являются разновидностями соединительной ткани (мезенхимальное происхождение). Для соединительной ткани характерно высокая доля содержания межклеточного матрикса. Межклеточный матрикс - сложный комплекс, связанных между собой макромолекул, которые секретируются самими клетками соединительной ткани - фибробластами, хондро- и остеобластами, одонтобластами или цементобластами. Основными компонентами межклеточного матрикса неминерализованной соединительной ткани являются: фибриллярные белки - коллаген, эластин фибронектин, лиминин; полисахариды - гликозаминогликаны, протеогликаны.

Преобладающий белок – коллаген, для синтеза которого абсолютно необходим витамин С, дефицит которого приведет к хрупкости сосудов, кровоточивости десен, выпадению зубов, анемии. Для образования зрелого коллагена также неоходимы витамины В6, В5, медь. Коллаген имеет специфический аминокислотный состав, в связи с чем обнаружение в моче оксипролина является показателем деградации коллагена.

Коллаген синтезируется в фибробластах соединительной ткани в клетках развивающегося зуба (одонтобласта, адомантобласта), в клетках цемента и в меньшей степени в клетках зрелого зуба и является матрицей минерализации. ?????

Нарушения синтеза и метаболизма основных структурных компонентов межклеточного матрикса вызывает многие известные патологии в том числе и органов ротовой полости.

Цель занятия: Изучить структурно-функциональные особенности соединительной ткани. Биохимию межклеточного матрикса.

Студент должен знать:

1. Особенности аминокислотного состава и структуры альфа - цепей коллагена.

2.Этапы синтеза и созревания коллагена. Формирование фибрилл.Гидроксилирование пролина и лизана, роль витамина С в этом процессе. Формирование трехцепочечной спирали тропоколлагена. Роль оксипролина и глицина в этом процессе.

3. Метаболизм коллагена и его регуляция.

4. Структурно-функциональная организация эластина.

5. Классификация и структурно-функциональная организация протеогликанов. Основные глюкозаминогликаны тканей зуба.

6.Неколлагеновые белки межклеточного матрикса. Виды, функции.

Студент должен уметь:

1. Объяснить роль коллагена в формировании зуба.

2. Объяснить роль витамина С синтезе коллагена.

3. Объяснить роль витамина В6 в формировании фибрилл коллагена.

4. Определить содержание сиаловых кислот в сыворотке крови. Анализировать полученные результаты.

5.Объяснить, почему гидроксипролин, выявляемый в моче, является маркером деградации коллагена.

Студент должен получить представление:

- о возможных патологиях, связанных с нарушением синтеза или катаболизма некоторых компонентов межклеточного матрикса (мукополисахаридозы, дефицит альфа-1антитрипсина);

- о бактериальных коллагеназах.

Сведения из базовых дисциплин, необходимые для изучения темы:

Гистологические особенности соединительной ткани и межклеточного матрикса: виды, происхождение, основные клетки соединительной ткани-продуценты компонентов межклеточного вещества.

- химическое строение глюкозаминогликанов.

Задания для самоподготовки:

Изучите материал темы в соответствии с целевыми вопросами («студент должен знать») и письменно выполните следующие задания:

1.Межклеточный матрикс – организованное вещество, заполняющее пространство между клетками, построен в основном из соединений четырех классов. Составьте таблицу « Основные компоненты межклеточного матрикса и их основные функции» по образцу:

Основные классы компонентов МКМ	Основные представители	Основные функции	Биохимические особенности, обуславливающие эти функции
Структурные белки
Глюкозамино- гликаны
Протеогликаны
Структурные Неколлагеновые белки

2. Коллаген ярко выраженный полиморфный белок. В настоящее время известно 19 типов коллагена. Чем отличаются типы коллагена друг от друга? Какой тип коллагена характерен для дентина?

3. Нарисуйте схематично структуру альфа-цепи коллагена типа I. Назовите особенности аминокислотного состава, определяющие основу функции этого соединения. Почему коллаген относится к гликопротеидам?

4. Последовательно запишите этапы синтеза и созревания коллагена.

5. Назовите роль фермента коллагеназы в метаболизме коллагена.

6. Назовите факторы, регулирующие скорость метаболизма коллагена и их эффекты.

Уясните, что коллаген участвует в процессе заживления раны через следующие процессы: в области заживления раны усиливается синтез коллагеновых волокон, они разрастаются, но их структура лишена регулярности, свойственной нормальным коллагеновым волокнам. Коллаген вызывает адгезию и агрегацию тромбоцитов, что способствует образованию защитной пленки на поверхности раны и заживлению. Эластин практически не участвует в заживлении.

7. Особенности структуры эластина, обеспечивающие его функции.

8. Схематично ( в виде рисунка) изобразите строение протеогликана. На схеме покажите белковую часть и глюкозаминогликаны.

9. Изучите строение глюкозаминогликана. Что является структурной единицей этих полимеров? Из чего состоит структурная единица глюкозаминогликанов? Назовите основное свойство протеогликанов, обеспечивающие их функции как структурных компонентов межклеточного вещества. В чем биологический смысл ацетилирования аминогрупп в молекуле аминосахара?

10. Назовите 6 классов глюкозаминогликанов. Какие из них характерны для тканей зуба?

11. Назовите роль гиалуроновой кислоты межклеточного вещества.

12. Назовите основные факторы, участвующие в метаболтизме протеогликанов: обновление и деградация.

13.Назовите основную роль фибронектина МКВ. Проиллюстрируйте ответ на рисунке.

14. Назовите некоторые антиадгезивные белки. Их значение.

15.Назовите особенность межклеточного матрикса кости и зубной ткани.

Аудиторная работа

Некоторые глюкозаминогликаны кроме повторяющихся дисахаридных единиц содержат другие простые сахара, в том числе сиаловые кислоты – производные нейраминовой кислоты. При деструкции соединительной ткани уровень сиаловых кислот в сыворотке крови возрастает.

Определении сиаловых кислот основано на получении безбелкового центрифугата сывортки крови, гидролизе ГАГ и гликопротеидов (последние не осаждаются при ТХУ), цветной реакции выделившися сиаловых кислот с раствором кипящих кислот.

Ход работы: В центрифужную пробирку внести 1 мл сыворотки крови, добавить 1 мл раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ), осторожном встряхнуть; пробирку поместить на кипящую водяную баню на 5 мин, затем охладить под проточной водой и центрифугировать 5 мин 2000 об/мин).

К 0,4 мл центрифугата добавить 5 мл уксусно-сернокислой смеси (95 частей ледяной уксусной кислоты + 5 частей концентрированной серной кислоты), нагревать на кипящей водяной бане 30 мин.

Бесцветный раствор постепенно приобретает красно-фиолетовое окрашивание. После охлаждения раствор колориметрировать в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм (фильтр зеленый).

Результат выражают в условных единицах: значение оптической плотности, умноженной на 1000. Норма: 135-200 усл. единиц.

Письменно выполните следующие задания:

1. Витамины С и В6 абсолютно необходимы для синтеза коллагена. Обьясните роль витаминов в формировании коллагена.

Проверьте свои знания:

2. Витамин С необходим на следующих этапах синтеза коллагена:

А. синтез альфа-спирали;

Б. гидроксилирования пролина в альфа-цепи;

В. гидроксилирование лизина в альфа-цепи;

Г. гликозилирование альфа-цепей

3. Гидроксильные группы оксипролина обеспечивают:

А. водородные связи при формирование трехцепочной спирали коллагена;

Б. ковалентные внутри и межцепочных связи (сшивки) при формировании зрелого коллагена

4. Подберите соответствующие пары:

А. Мутации в ДНК фибробластов; Б. Дефицит ионов меди и витамина В6

В. Дефицит витамина С.

1. Снижение активности пролилгидроксилазы;

2. Изменение первичной структуры коллагена;