5. 2.4. Образование супероксидного анион-радикала надфн-оксидазой

В 1973 году Бернардом Бэбиором и сотрудниками была впервые показана связь дыхательного взрыва стимулированных фагоцитов с продукцией супероксидного анион-радикала мембраносвязанной НАДФН-оксидазой.

НАДФН-оксидаза фагоцитов является ферментативным комплексом, который осуществляет восстановление молекулярного кислорода с образованием О₂^. в реакции:

3. НАДФН + 2О₂ → НАДФ⁺ + 2 О₂^. + Н⁺

В процессе развития дыхательного, или метаболического взрыва, нейтрофилов млекопитающих до 90 % потребляемого кислорода может расходоваться на образование О₂^..

В настоящее время установлено, что наибольшей способностью продуцировать О₂^. в животных организмах обладают фагоциты, которые при стимуляции могут нарабатывать 10 нмоль О₂^./часх10⁴ клеток.

4. Структура надфн-оксидазы

НАДФН-оксидаза состоит из 6 гетерогенных субъединиц, среди которых 2 мембраносвязанные (gp 91, p 22) и 4 цитозольных (p 47, p 40, p 67, Rac), которые под влиянием стимуляторов объединяются в ферментативный комплекс, генерирующий О₂^.. С целью предотвращения деструкции собственной ткани («сопутствующее повреждение») активность НАДФН-оксидазы ограничена в пространстве (фагосома) и во времени (аутодеактивация фермента).

Важнейший компонент НАДФН-оксидазы – цитохром b₅₅₈ , имеет окислительно-востановительный потенциал (Е_о¹ = -245 мВ). Цитохром b₅₅₈ – гетеродимер, состоит из гликопротеина - -субъединицы (gp 91) и α-субъединицы (р 22). -субъединица (gp 91) содержит 6 трансмембранные α-спирали на N-конце и участки гликозилирования. С-конец имеет сайты связывания ФАД и НАДФН. α-субъединица (р 22) имеет на N-конце 2 трансмембранных α-спиралей, С-конец не имеет вторичной структуры и содержит полипролиновый мотив (необходим для связывания субъединицы р 47). В состав цитохрома b₅₅₈ входит два гема, тетрапиррольные структуры которых располагаются перпендикулярно плоскости мембраны. Причем, гемовые группы расположены в мембране определенным образом: одна ближе к внутренней поверхности (внутренний гем), обращенной к цитоплазме, а другая – к внешней (внешний гемм), обращенной к фагосоме. Для переноса электрона с цитозольных НАДФН и ФАДН₂ на внеклеточный кислород с достаточной скоростью необходимы 2 редокс-участка. Причем, гемы имеют разные редокс-потенциалы, составляющие -225 мВ и -265 мВ.

Таким образом, цитохром b₅₅₈ является флавоцитохромом.

Рис.9. Модель флавоцитохрома b₅₅₈: I-IY и II-I – трансмембранные субдомены субъединиц gp 91 и р 22; ромбы – гемовые группы; Y – участки гликозилирования, р- полипролиновый мотив

В нестимулированных фагоцитах человека 85 % цитохрома b₅₅₈ локализовано на мембранах специфических гранул, 5 % - на цитоплазматической мембране и 10 % - в специальных секреторных везикулах. Таким образом, субъединица gp 91 содержит все редокс-компоненты НАДФН-оксидазы, необходимые для трансмембранного переноса электронов на кислород с образованием О₂^..

5. Каталитический цикл надфн-оксидазы

Каталитический цикл начинается с переноса 2 е^- от НАДФН на ФАД с образованием ФАДН₂. Здесь ФАД используется для переключения двухэлектронного переноса на одноэлектронный. Далее электрон переносится на внутренний гем, расположенный ближе к цитоплазматической поверхности мембраны (Е₀¹ = - 225мВ), с образованием семихинона ФАДН^.. Затем электрон передается на внешний гемм (Е₀¹ = -265 мВ) и затем на кислород с образованием О₂^.. ФАДН^. также служит доноров электронов:

НАДФН → ФАД → ФАДН^. → гем_(внутр) → гем_(внеш) → О₂ → О₂^..

Каталитический цикл НАДФН-оксидазы осуществляется субъединицей gp 91, но не может функционировать изолированно от субъединицы р 22 и цитоплазматических факторов, которые инициируют ферментативную активность, способствуют переносу электронов и деактивируют фермент.

Субъединица р 47 является регуляторным и адапторным белком, который облегчает и усиливает взаимодействие компонентов НАДФН-оксидазы в 50-100 раз. Она получила название «организатор НАДФН-оксидазы», ее N-концевой домен связан с фосфолипидами мембраны и актином цитоскелета. В покоящейся клетке субъединица р 47 самоингибирована и имеет замкнутую конформацию. При стимуляции фагоцита р 47 фосфорилируется, что приводит к конформационным изменениям, взаимодействию субъединиц и самосборке всего комплекса.

Субъединица р 67 относится к семейству «активаторов НАДФН-оксидазы», ее домен активации абсолютно необходим для генерации О₂^.., так как взаимодействует с цитохромом b₅₅₈ и участвует в переносе электронов.

При стимуляции фагоцитов происходит быстрая (в течение 2 с) самосборка НАДФН-оксидазного комплекса, который генерирует О₂^..

НАДФН-оксидаза, продуцируя О₂^.., играет ведущую роль в создании бактерицидного, цитоксического потенциала организма, а также может выполнять иммунорегуляторные функции.

Известно наследственное заболевание – хронических гранулематоз, связанный с отсутствием или дисфункцией основных компонентов НАДФН-оксидазы. Частота встречаемости – 1 случай на 200 000-250 000 новорожденных. Патология начала выявляться в 50-е годы 20 века, а в 1957 году получила название «детский фатальный хронический гранулематоз». Затем было установлено, что полиморфноядерные лейкоциты больных не способны к развитию дыхательного «взрыва», что связано с дефектом генов, кодирующих р 22, gp 91, р 47, р 67. Заболевание проявляется дефицитом или полным отсутствием НАДФН-оксидазы. Заболевание характеризуется часто повторяющимися тяжелыми инфекциями, которые сопровождаются лимфоаденопатией и образованием обширных гранулем в мягких тканях.