Тема №3 «Бактериологические красители. Техника приготовления окрашенных препаратов бактерий. Простые и сложные методы окраски»

Цель занятия: изучить состав красителей, научиться делать мазки и мазки-отпечатки, изучить методы и технику окрашивания.

Материалы и оборудование: предметные стекла, спиртовки, реактивы для окрашивания, фильтровальная бумага, сифон с дистиллированной водой.

Бактерии микроскопируют в живом и неживом виде. Исследование в живом состоянии необходимо для определения «подвижности» (метод «висячей» или «раздавленной» капли). Для изучения морфологии бактерий (формы и структурных элементов), тинкториальных особенностей (способность воспринимать окраску) применяют окрашивание в неживом состоянии.

Для окрашивания применяют анилиновые красители (основные и нейтральные), кислые краски непригодны (вследствие химического состава клетки). Для микроскопирования используют различные методы окрашивания, которые требуют красителей разного цвета: кристалл-, метил-, генцианвиолет – фиолетовый цвет; фуксин, сафранин – красный; метиленовый синий – синий; малахитовый или бриллиантовая зелень – зеленый. Эти красители поступают в продажу в виде порошка или кристаллов, из которых готовят насыщенный спиртовой раствор, но к непосредственной окраске они непригодны. Из насыщенных спиртовых растворов готовят водно-спиртовые растворы, путем добавления дистиллированной воды. Такие растворы менее стойкие, но применяются длительное время. В отдельных случаях готовят раствор красителей, которые используют в свежеприготовленном виде.

Для повышения действия спиртоводных растворов красок применяют протраву (разрушает клеточную оболочку). Физическая протрава нагревание: использование горячих растворов красителей или раствор краски наливают на препарат и снизу подогревают на пламени до появления паров. Химическая протрава фенол, КОН, которые добавляют к растворам красителей или перед окрашиванием препарат обрабатывают слабыми растворами кислот (HCl, H2SO4) после чего смывают водой и окрашивают. Из спиртоводных растворов используют: карболовый фуксин (фуксин Циля, фуксин Пфейффера), генцианвиолет, метиленовый синий (щелочной раствор Лефлера), водный раствор сафранина, малахитовая или бриллиантовая зелень.

Препарат для микроскопирования готовят на предметном стекле. Материалом может быть: гной, кровь, взвесь бактериальных культур – препараты-мазки, а из ткани органов (печень, селезенка, лимфоузлы) – препараты-отпечатки.

Высушенный на воздухе мазок фиксируют – закрепляют на стекле (и обеззараживают). Фиксация выполняет следующие функции: быстро убивает микроорганизмы (медленная гибель ведет к аутолизу), обеспечивает лучшее прилипание к стеклу, делает мазок более восприимчивым к окраске (у мертвых клеток нарушена целостность мембран). Физический способ оборотной стороной мазка 2-3 раза слегка проводят над пламенем горелки. Химический способ использование спирта, эфира, формалина, смеси Никифорова (спирт+эфир 1:1), жидкость Карнуа (спирт+хлороформ+ледяная уксусная кислота). Высушенный мазок опускают в стакан с фиксирующей жидкостью или капают 1-2 капли на препарат на 3-5 минут, промывают, сушат.

Окрашивание – совокупность методов и приемов для исследоания внешнего и внутреннего строения микроорганизмов, матод микробиологической техники, позволяющие различать виды микроорганизмов.

Простой метод окраски. При данном методе используют только один краситель. На фиксированный препарат, помещенный на мостике над сливной чашкой, наливают красящий раствор (метиленовой сини 4...5 мин, генцианвиолет 1-2 мин). Краску смывают водой из бутыли, препарат высушивают фильтровальной бумагой и наносят каплю иммерсионного масла. Готовый препарат помещают на предметный столик и микроскопируют. Данный метод позволяет быстро ознакомиться с микрофлорой мазка.

Сложные (дифференцирующие) методы окраски. Отличаются от простых методов тем, что препарат окрашивают несколькими красками, а в отдельных случаях используют еще специальные реактивы (раствор Люголя, кислоты и др.). Сложные методы позволяют выявить наличие (или отсутствие) отдельных структурных элементов и некоторых органических соединений клетки, чем и определяют тинкториальные свойства каждого вида микроба.

Метод окраски по Граму. Фиксированный препарат окрашивают карболовым генцианвиолетом в течение 2...3 мин. Не смывая водой, краску сливают и на 2...3 мин на препарат наносят раствор Люголя (йода кристаллического — 1 г; йодистого калия как растворителя йода — 2 г; дистиллированной воды — 300 мл). Раствор Люголя сливают; препарат, не промывая водой, обрабатывают 96%-м спиртом в течение 30 с, затем хорошо промывают водой. После этого препарат дополнительно окрашивают рабочим раствором фуксина (до 1 мин), вновь промывают водой, сушат фильтровальной бумагой и микроскопируют.

При окраске по Граму одни виды бактерий не обесцвечиваются спиртом после первичного окрашивания и сохраняют фиолетовый цвет; их называют грамположительными (фирмикутные). Другие виды обесцвечиваются спиртом, а затем воспринимают дополнительную окраску фуксином и приобретают розово-красный цвет; их называют грамотрицательными (грациликутные). Окрашивание по Граму обусловлено структурными особенностями клеточной стенки у грамположительных и грамотрицательных групп микробов, длиной и формой ее пор, неодинаковым химическим составом и строением пептидогликанового слоя клеточной стенки микроорганизмов. Генцианвиолет (или кристаллвиолет) и нуклеиновые кислоты цитоплазмы в присутствии йода (раствор Люголя) образуют прочный комплекс, нерастворимый в воде и слаборастворимый в спирте. Поэтому при действии спиртом в течение 30 с бактерии с многослойным пептидогликановым каркасом (грамположительные) не обесцвечиваются. У грамотрицательных бактерий пептидогликановый слой имеет более крупные поры, что облегчает прохождение спирта; образовавшийся комплекс разрушается, клетка обесцвечивается.