Тема №2. Микроскопический метод исследования микроорганизмов.

Цель занятия: научиться пользоваться микроскопом, изучить морфологию микроорганизмов.

Материалы: микроскоп, колбы, чашки Петри, штативы с пробирками, иммерсионное масло, предметные и покровные стекла

При выполнении любых микробиологических исследований необходимо точно знать особенности строения микроорганизмов. Эти сведения могут быть получены только путем изучения данного организма с помощью микроскопа. Первый простейшего устройства оптический микроскоп был сконструирован Антони ван Левенгуком (рис. 1).

В настоящее время многие вопросы цитологии микробов решаются на уровне электронной микроскопии. Микробиологические лаборатории оснащены микроскопами различных моделей: МБР-1, МБИ-1, МБИ-2, МБИ-3, МБИ-6, «Биолам», Р-1 и др. Микроскопированием определяют морфологические особенности микроорганизмов, их тинкториальные (способность окрашиваться теми или иными красителями) свойства, подвижность, наличие специальных структурных элементов (спора, капсула).

Современный микроскоп состоит из оптической и механической частей. К механической части относятся штатив, тубус (труба) с револьверным устройством, предметный столик, механизм тонкой и грубой наводки (рис. 1).Штатив состоит из двух частей: держателя трубы микроскопа и массивной которая служит опорой микроскопа.

Рис. 1. Устройство оптического микроскопа:

1— основание микроскопа; 2 — рукоятка макрометрического винта; 3 — тубусодержатель; 4—тубус; 5—окуляр; 6— револьвер объективов; 7—объектив; 8—предметный столик; 9—конденсор; 10— осветитель; 11 — рукоятка микрометрического винта

На штативе укреплен подвижный столик, который приводится в движение двумя винтами, расположенными по его бокам. При помощи этих винтов препарат вместе со столиком вращается и перемещается в разных направлениях, что облегчает его рассмотрение.

В тубусе находится оптическая система. Он перемещается вверх и вниз при помощи двух винтов. Для более грубого перемещения служит зубчатка, или кремальера. Точная установка достигается движением микровинта с мелкой нарезкой: полный оборот микровинта передвигает тубус на 0,1 мм.

В нижней части тубуса имеется револьверное устройство, в которое можно ввинчивать 4 объектива (на некоторых микроскопах 5) и переключать их во время работы. В верхнее отверстие тубуса вставляется окуляр.

Оптическая часть микроскопа состоит из окуляров, объективов, конденсора и зеркала.

Зеркало отражает падающий на него свет и направляет его в конденсор для освещения препарата. Одна сторона зеркала плоская; ею пользуются при любом источнике света и при любом увеличении. Другая, вогнутая, сторона зеркала предназначена для работы без конденсора при малых увеличениях.

Конденсор состоит из нескольких линз, собирающих отраженный зеркалом свет в пучок и направляющих его па плоскость препарата. В нижней части конденсора расположена ирисовая диафрагма, посредством которой можно менять угол лучей и количество пропускаемого конденсором света. Фокусировку конденсора осуществляют специальным микровинтом.

Наиболее важная часть микроскопа — объектив. Он представляет собой систему линз, строящих действительное, увеличенное и перевернутое изображение объекта. Используют 2 типа объективов: погруженный (иммерсионный), сухой. Иммерсионный объектив дает наибольшее увеличение. Используют кедровое масло.

Окуляр микроскопа — это увеличивающая оптическая система, через которую рассматривается действительное изображение объекта, которое дает объектив. Окуляр состоит из двух линз: собирающей, обращенной к объективу, и глазной, обращенной к глазу. Между ними находится диафрагма, которая задерживает боковые лучи и пропускает лучи, близкие к оптической оси и дающие более контрастное изображение. Окуляр еще раз увеличивает построенное объективом изображение объекта, но не раскрывает новых деталей его строения.

Классификация (таксономия) микроорганизмов. Вначале в основу классификации микроорганизмов были положены морфологические признаки, так как больше о них человек ничего не знал. В 1896 г. К. Леман и Р. Нейман предприняли попытки объединить микроорганизмы в три группы: шаровидные (Соссасеае), палочковидные (Bacteriaceae) и извитые (Spirillaceae). В 1897 г. для систематики микробов стали использовать наряду с морфологическими и физиологические признаки. Как выяснилось впоследствии, для научно обоснованной классификации одних каких-нибудь признаков бывает недостаточно. Поэтому в настоящее время используют комплекс признаков: фенотипические (морфологические, культуральные, физиологические и другие свойства), а также генотипические (физико-химические свойства ДНК).

Для обозначения микроорганизмов принята двойная (бинарная) номенклатура, которая включает в себя названия рода и вида. Родовое название пишется с прописной буквы, видовое, даже происходящее от фамилии, — со строчной. Например, бациллу сибирской язвы называют Bacillus anthracis, кишечную палочку — Esherichia coli, возбудителя эмфизематозного карбункула — Clostridium chauvoei и т. д.

Основной (низшей) таксономической единицей является вид. Виды - в роды, роды — в семейства, семейства — в порядки, порядки — в классы, классы — в отделы, отделы — в царства.

Вид — это совокупность популяций, имеющих общее происхождение и генотип, морфологические, физиологические и другие признаки, способные в определенных условиях вызывать одинаковые процессы.

Культура — микроорганизмы, полученные от животного, чело­века, растения или субстрата внешней среды и выращенные на питательной среде. Чистые культуры состоят из особей одного вида, смешанные представляют собой скопления клеток разных видов. Микробиологи часто употребляют слово «штамм».

Штамм — это культура -одного и того же вида, выделенная из разных сред и отличающаяся незначительными изменениями свойств (неодинаковая биохимическая активность, чувствитель­ность к лекарственным веществам и т. д.). Например, кишечная палочка, выделенная от крупного рогатого скота, и такая же палочка, выделенная от свиней, могут быть разными штаммами.

Клон — культура микроорганизмов, выделенная из одной клетки.

В названиях микробов, различающихся по некоторым свойствам, вместо суф- фикса «тип» введен суффикс «вар». Так, биотип называют биовар, серотип — серовар, фаготип — фаговар и т. д.

Форма и строение микробов. Микробы - одноклеточные бесхлорофилльные организмы прокариотического типа. По форме отмечают палочковидные, извитые микробы. Основными формами имеются переходные (коккобактерии и др.).

Ш аровидные (кокковые Соссасеае) микробы по форме напоминают шар, но бывают овальные, плоские, односторонне вогнутые или слегка вытянутые.Характеризуются отсутствием подвижности и способности к спорообразованию, однако некоторые бактерии способны образовывать цисты. Шаровидные формы образуются в результате деления клеток в одной, двух, трех взаимно перпендикулярных или разных плоскостях. При делении клеток в одной плоскости клетки могут располагаться попарно, в связи, с чем такие формы получили название диплококков. Если деление происходит последовательно в одной плоскости и клетки соединены в виде цепочки — это стрептококки. Деление кокка в двух взаимно перпендикулярных плоскостях ведет к образованию четырех клеток, или тетракокка. Пакетообразные кокки, или сарцины, — результат деления кокков в трех взаимно перпендикулярных плоскостях. Беспорядочное расположение клеток или образование скоплений, напоминающих гроздья винограда, происходит при делении кокков в разных плоскостях; такие формы называются стафилококками.

Рис. 2. Основные формы микроорганизмов (схема): шаровидные: 1— стафилококки, 2 — диплококки, 3 — стрептококки, 4 — тетракокки, 5— сарцины; палочковидные: 6—бактерии, 7—стрептобакте-рии, 8— бациллы, 9— стрептобациллы; извитые: 10— вибрионы, 11 — спи­риллы, 12 — спирохеты

Палочковидные, или цилиндрические (Bacteriaceae) формы принято делить на бактерии, бациллы и клостридии. Вытянутой формы, концы могут быть ровными, заостренными, закругленными. Имеются подвижные и неподвижные представители. Движение зависит от видовой принадлежности, возраста культуры и условий выращивания. Подвижные формы передвигаются с помощью жгутиков. Некоторые бактерии могут образовывать споры, которые служат для переживания неблагоприятных внешних условий, отличаются высокой устойчивостью к колебаниям температуры, высушиванию, воздействию химических веществ. Они имеют утолщенную стенку, низкое содержание воды, замедленные метаболические процессы. После формирования споры оболочка и содержимое материнской клетки разрушается. Попадая в благоприятные условия спора, превращается в вегетативную клетку. Бактерии — палочковидные формы, не образующие спор (пишут Bact., например Bact. aceti). Бациллы (аэробы)— палочковидные формы, образующие споры (пишут Вас. например Вас. subtilis). Клостридии (анаэробы) - палочковидные формы, образующие споры, превышающие по ширине вегетативную клетку. Такие формы напоминают веретено, ракетку, лимон, барабанную палочку.

Плеоморфизм – изменение формы в процессе развития. Клостридии принимают, участие во многих процессах в природе. Являются возбудителями анаэробных инфекций. Вызывают аммонификацию белковых веществ, мочевины. Разлагают фосфорорганические соединения. Фиксируют молекулярный азот.

Палочки, как и кокки, могут располагаться попарно или цепочкой. При соединении бактерий попарно образуются диплобактерии, при таком же соединении бацилл — диплобациллы.

Извитые формы микробов (Spirillaceae) определяют не только по длине и диаметру, но и по количеству завитков. Вибрионы напоминают по форме запятую.

Спириллы — извитые формы, образующие до 3—5 завитков, подвижны. Спирохеты — тонкие длинные извитые формы с множеством завитков. Подвижны. Имеют первичные (изгиб протоплазматического цилиндра) и вторичные (изгибы всего тела) завитки. Могут образовывать цисту.

По количеству и расположению жгутиков выделяют следующие бактерии: монотрихи — бактерии с одним полярно расположенным жгутиком , амфитрихи — бактерии с двумя полярно расположенными жгутиками или имеющие по пучку жгутиков на обоих концах; лофотрихи — бактерии, имеющие пучок жгутиков на одном конце клетки; перитрихи — бактерии с множеством жгутиков, расположенных по бокам клетки или на всей ее поверхности.

Бактерии, не имеющие жгутиков, называют атрихиями. Нить жгутика состоит из 3 частей: крюк, базальное тельце. Наличие жгутиков у бактерий зависит от температуры их выращивания.

Бактерии передвигаются беспорядочно, однако они способны к направленным формам движения — таксисам, в зависимости от внешних стимулов. Реагируя на различные факторы окружающей среды, бактерии за короткое время локализуются в оптимальной зоне обитания. Таксис может быть положительным и отрицательным. Принято различать: хемотаксис, аэротаксис, фототаксис, магнитотаксис.