Тема №10. Бактериофаги (биологические факторы)

Цель занятия. Усвоить методику титрования бактериофагов (определение их активности), практическое использование фага, диагностическое значение реакции нарастания титра фага.

Материалы и оборудование. Пробирки с фагом, пробирки с гомологичной фагу бактериальной культурой (вакцинный штамм В. anthracis или другие фаги и культуры), чистые сухие пробирки, градуированные пипетки, пастеровские пипетки, стерильные чашки Петри с МПА, смесь бактериальной культуры с фагом, фильтры Зейтца (стерильные). Таблицы — морфология фага, колония фага на пластинчатом агаре (стерильные пятна).

Бактериофаги (фаги) характеризуются главным образом своим литическим действием на гомологичные им виды бактерий. Это явление называется Бактериофагией (греч. phagein — пожирать). Фаги — вирусы определенной, формы и структуры. О присутствии фага судят по его специфическому действию на соответствующий вид бактерий. Название фага происходит от названия вида микроба, лизируемого данным фагом (коли-фаг, суипести-фер-фаг, сибиреязвенный гамма-фаг и др.). Хотя фаги отличаются специфичностью по отношению к гомологичному виду микроба, но действуют также и на группу родственных видов бактерий. Фаги обладают антигенными свойствами, их используют для гипериммунизации животных с целью получения антифаговых диагностических сывороток. Лизирующее действие фага внешне выражается полным просветлением бульонных культур и образованием прозрачных участков среди сплошного роста бактерий на засеянной поверхности плотной среды (стерильные пятна).

Методика обнаружения фага. 1. В две пробирки с жидкой средой засевают гомологичную фагу бактериальную культуру. В одну из пробирок пастеровской пипеткой вносят каплю фага. Обе пробирки помещают в термостат. Через 16-18 ч в пробирке, где находился фаг, вследствие лизисабактерий под его влиянием бульон просветляется. В другой пробирке (без фага) наблюдается обильный рост засеянной культуры.

Обе засеянные пробирки ставят в термостат, через 4— 6 ч роста культуры при четко выраженном помутнении среды в одну из пробирок вносят каплю специфического фага и обе пробирки вновь ставят в термостат и учитывают результат через 16-18 ч (после первоначального посева). В пробирке с фагом среда просветляется, а без фага — она становится еще более мутной (обильный рост культуры).

Для выявления действия фага на плотной среде бульонную культуру высевают на агар в чашках Петри: 1 каплю культуры растирают стеклянным шпателем по всей поверхности агара, крышку закрывают, чашки помещают в термостат на 3—4 ч. Затем в одну чашку на агаре с молодой культурой вносят фаг по одной капле в нескольких местах и вновь чашки ставят в термостат на сутки. По истечении этого времени в контрольной чашке (без фага) обычно наблюдается обильный сплошной рост бактерий по всей поверхности среды; в чашке с добавленным фагом наблюдается задержка роста бактерий в местах нахождения капель с фагом.

Фаг используют: 1) для фагодиагностики возбудителей сибирской язвы, сальмонеллеза и некоторых других (путем обнаружения специфического фага в исследуемом материале и воздействием специфического фага на бактериальную культуру, выделенную из исследуемого материала); 2) для лечения и профилактики инфекционных болезней (сальмонеллез, колибактериоз).

Для практических целей фаги серийно производят на биофабриках. Каждая серия фага перед ее выпуском проверяется на активность, то есть проверяют титр фага — его наименьшая концентрация (или наибольшая степень разведения), которая способна лизировать гомологичную культуру. Чем выше степень разведения, тем активнее фаг. Титрование фага осуществляют как в жидких, так и на плотных средах.

Методика титрования фага. В пробирки разливают МПБ (по 4,5 мл в каждую), затем в первую пробирку вносят 0,5 мл исследуемого фага, перемешивают и делают последовательные разведения — из первой пробирки во вторую (по 0,5 мл), из второй переносят в третью и т. д., уменьшая концентрацию (в каждой пробирке) в 10 раз. В пробирки с разведенным фагом вносят по 1 капле суточной культуры соответствующих бактерий, встряхивают, лизисе пробирки ставят в термостат на сутки, затем учитывают результат — титр. Фаг считается достаточно активным, если он лизирует в разведениях 10^-5—10^-8

При титрации фага на плотной среде чашки Петри с МПА засевают культурой по всей поверхности агара и разделяют на сектора, в каждый сектор вносят по капле фага различной концентрации, ставят в термостат. Результат учитывают через сутки