50. Умови, необхідні для злиття протопластів рослин.

Во время слияния протопластов сначала происходит их слипание (аглютинация), а затем собственное слияние мембран. Протопласты имеют отрицательные поверхностный заряд, потому взаимно отталкиваются.(поэтомуиспользуют методы снятия, или перераспределения поверхностного заряда). Для индуктируемого слияния протопластов используется химический и электрический методы.

Химический метод заключается в добавлении в суспензию протопластов веществ, которые стимулируют слияние. Самым распространенным является полиэтиленгликоль (ПЭГ) - хорошо растворимый в воде полимер. Предварительная обработка суспензии смешанных протопластов концентрированным раствором ПЭГ (20-30 %) вызывает их слияние. Через 10-15 мин ПЭГ удаляется отмыванием раствором с щелочным рН (9-11) и высоким содержанием Са²⁺ (100-300 мМ), и в этом растворе, мембраны протопластов сливаются. Применяя ПЭГ, можно соединить от 10 до 50 % протопластов. Метод имеет недостатки: часть протопластов повреждается и погибает; часто сливаются не два, а больше протопластов, которые оказываются нежизнеспособными.

Электрический метод. При этом для агглютинации и слияния протопластов используют электрическое поле (в суспензию помещают два электрода). Переменный ток вызывает диэлекгрофорез, протопласты выстраиваются в ряд, присоединяясь своими полярными поверхностями друг к другу. Такие цепочки стабильны только в течение времени существования электрического поля. Слияние под действием электрического поля происходит с высокой эффективностью без применения химических стимуляторов, при комнатной температуре и физиологичных значениях рН. Однако метод электрослияния требует дорогого оборудования, и потому часто для слияния протопластов применяют разнообразные модификации химического метода.

51. Кріоконсервування ембріонів тварин.

Эффективность трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота во многом определяется условиями хранения зигот. Самым эффективным и перспективным методом консервации эмбрионов является их глубокое замораживание (криоконсервация) в жидком азоте при температуре -196 градусов.

Долговременное хранение глубокозамороженных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Отпадает необходимость в содержании больших стад или групп реципиентов, так как пересадки могут быть проведены в любое время независимо от сроков взятия эмбрионов от доноров, что существенно повышает рентабельность трансплантации. Кроме того, криоконсервация эмбрионов позволяет создавать эмбриобанки от генетически ценных животных, а также сохранять генофонд редких и исчезающих пород и транспортировать эмбрионы в любые страны мира.

При соблюдении правильной биотехнологии выживаемость эмбрионов составляет 90%, а стельность коров-реципиентов после нехирургической пересадки находится в пределах 50-55%.

Эмбрионы замораживают в пробирках или в ампулах. Ампулы перед замораживанием запаивают на пламени газовой горелки. Ампулы или пробирки маркируют, затем охлаждают, проводят кристаллизацию, охлаждение со скоростью и погружают в жидкий азот. Оттаивание эмбрионов производится на водяной бане. Для хранения и транспортировки замороженных эмбрионов используют сосуды Дьюара различных типов.

Для успешной криоконсервации следует отбирать эмбрионы без морфологических нарушений, находящиеся на стадиях поздней морулы или ранней бластоцисты.

По прогнозу специалистов, криоконсервированные эмбрионы могут храниться десятки и сотни лет.