Задача 44

Радиационная стерилизация лекарственных средств.

Как следует из представленного в указанной лекции материала, биосинтез лекарственных препаратов ведется в асептических условиях. При выделении, очистке и получении лекарственных форм также соблюдаются максимально возможные предосторожности против контаминации. Тем не менее, проблема стерильности инъекционных препаратов и обсемененности препаратов для наружного применения остается одной из самых сложных для производства лекарственных средств. Приводим в краткой форме некоторые данные о методе радиационной стерилизации, считая в тоже время, что сфера ее приложения, в основном -нестандартные ситуации, создающиеся при обнаружении нестерильных уже расфасованных серий препаратов.

Определенные виды ионизирующей радиации допустимы для стерилизации лекарственных средств. Соответствующие указания имеются в официальных фармакопейных документах.

Хорошо известно, что ионизирующей радиацией стерилизуются хирургические инструменты, резиновые перчатки, шприцы одноразового пользования и т.п.

Рассмотрим вопросы, связанные с радиационной стерилизацией лекарственных препаратов. Сразу же следует подчеркнуть, что при такой стерилизации (в минимальных дозах) загрязняющие препарат микроорганизмы теряют способность к размножению и гибнут вследствие повреждения ДНК- происходят сшивки между нуклеотидами, а также разрывы ДНК.

При термической стерилизации (в отличие от радиационной) происходит денатурация многих белков клетки, в результате чего повреждения ее становятся более многочисленны.

При стерилизации путем мембранной фильтрации ( с использованием ультрафильтров) микробные клетки не убиваются, а удаляются из лекарственного препарата. В реальных условиях радиационная или лучевая (жаргонный термин) стерилизация используется на отдельных производствах. Это происходит иногда ввиду объективных трудностей при внедрении технологии получения нового препарата, а иногда по экономическим причинам.

Давно установлено, что стерилизующая доза ионизирующего облучения - 2,5 миллиона рад, то есть 2,5 мегарад (2,5 Мрад); 1 рад, или 1 rad (radiation absorbed dose) соответствует 100 эрг/г.

Фармацевт должен занимать грамотную и достаточно четкую позицию в отношении бытующей радиофобии, конкретно выражающейся в том, что радиационная стерилизация может, якобы, привести к наведенной радиоактивности облученных препаратов.

Разрешенные для стерилизации лекарств - гамма лучи изотопа кобальта (кобальта шестьдесят) и быстрые электроны с энергией не выше пяти миллионов электроновольт, получаемые на ускорителях, наведенной радиации у обработанных ими препаратов вызвать не могут, независимо от поглощенной дозы облучения, так как неспособны вызвать расщепление атомного ядра.

Гамма-лучи (Со⁶⁰) распространяются в воздухе на несколько десятков метров, в воде - на несколько десятков сантиметров, в свинце - на несколько сантиметров. На промышленной установке защитный слой воды, окружающий герметическую стерилизационную камеру, где

О ТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

находятся стандартные стержни с (Со⁶⁰), длиной до одного метра и упаковки со стерилизуемым лекарственным препаратом, должны составлять несколько метров. Стерилизационная камера снабжена автоматизированным дистанционным управлением, позволяющим вдвигать в нее и удалять из нее стержни с кобальтом, разъединяя, таким образом, источник облучения и упаковки со стерилизуемым препаратом.

Режим стерилизации обычно подбирается с таким расчетом, чтобы стерилизующая доза ( 2,5 Мрад) набиралась облучаемым препаратом примерно за сутки. При этом следует иметь ввиду, что период полураспада (Со⁶⁰) составляет около пяти лет. Естественно, что работа на установках с радиоактивным кобальтом постоянно требует особых мер предосторожности.

Установка, где для стерилизации используются быстрые электроны во многом принципиально отличается от указанной выше. Проникающая способность электронов, разогнанных до разрешаемого для стерилизации лекарств показателя, невелика. Электроны не могут "пронизать" несколько рядов флаконов или ампул. Однако, чтобы набрать стерилизующую дозу (2,5 Мрад), требуются секунды или доли секунд. Флаконы подаются по одному с помощью транспортера к соответствующему "окошку", набирают стерилизующую дозу и двигаются дальше.

При выключении стерилизационная установка такого рода становится абсолютно безопасной в отношении радиации. Значительный опыт по радиационной стерилизации биотехнологических препаратов накоплен на примере антибиотиков. Стерилизации подвергались расфасованные по флаконам лиофильно высушенные субстанции, соли антибиотиков и их препараты с различного рода наполнителями. В ряде случаев препараты искусственно заражались различными видами микроорганизмов и их спорами. Доза 2,5 Мрад (гамма лучи кобальта, быстрые электроны) обусловливала гарантированную стерильность. Облученные препараты сохраняли активность и удовлетворяли фармакопейным тестам. При сравнении их с необлученными препаратами можно выявить некоторые отличия. Так, белые (бесцветные) порошки теряли "блестящий" оттенок и приобретали матовый. Разница обнаруживалась только при непосредственном сравнении. Порошки красного цвета (актинолицины) и желтого (тетрациклины) приобретали несколько более тусклый оттенок, что тем не менее не сказывалось на активности самого препарата. Можно говорить о несколько худшем товарном виде препаратов, но не о том, что они не соответствуют фармакопейным требованиям. Это характерно для большинства проверенных антибиотиков (природные и полу синтетические пенициллины, аминогликозиды, тетрациклины и ряд других). Исключение составляли полиены, то есть структуры с сопряженными двойными связями - например, нистатин, который при облучении заметно терял активность.

Специалист с фармацевтическим образованием должен быть знакомым с применением радиационной стерилизации: в случае расфасованных во флаконы и ампулы препаратов, предназначенных для инъекций. Под влиянием облучения изменяется кристаллическая решетка стекла. Оно темнеет, мутнеет и приобретает, таким образом, непривлекательный, с коммерческой точки зрения вид, хотя полностью сохраняет свои функциональные качества. Потемнение обратимо, но при комнатной температуре это происходит медленно - в течение ряда месяцев. Не выпускать облученные препараты в течение такого срока в аптечную сеть -значит, сократить для потребителя срок годности облученных серий. Теоретически для

О ТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 2 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 3

изготовления флаконов и ампул можно использовать стекло с некоторыми редкоземельными элементами (марки стекла такого типа применяются в военной технике). Однако, это стекло слишком дорого для изготовления из него сотен миллионов единиц стандартных изделий.

О ТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ < 3

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | 1 ►

Задача 45

Промышленное производство рекомбинантного инсулина

Инсулин, как вы знаете, является регулятором углеводного обмена. В организме человека инсулин синтезируется в бетаклетках островков Лангерганса поджелудочной железы. При отсутствии или недостатке его синтеза развивается такое заболевание как сахарный диабет (инсулинозависимый диабет - 1 типа). При сахарном диабете повышается содержание глюкозы в крови и развиваются патологические процессы. Диабет II типа (инсулинозависимый) возникает при дефектах в структуре рецепторов, отвечающих за проникновение глюкозы в клетку. Все эти сведения касаются этиологии такого заболевания как сахарный диабет.

Следующий вопрос, который надо рассмотреть, это структура инсулина. Итак, инсулин это пептидный гормон, состоящий из двух пептидных цепей: А-цепь состоит из 21 аминокислотных остатков. В-цепь состоит из 30 аминокислотных остатков

Эти две цепи связаны бисульфидными SS связями, которые обеспечивают пространственную структуру белка инсулина. Рис.

При синтезе инсулина в поджелудочной железе вначале образуется предшественник инсулина,

так называемый проинсулин. Этот проинсулин состоит из А-цепи, В-цепи и С-пептида,

состоящего из 35 аминокислотных остатков.

С-пептид отщепляется под действием карбоксипептидазы и трипсина и проинсулин переходит в

активный инсулин.

Есть разные способы получения инсулина. Мы остановимся на получении инсулина

биосинтетическим путем, с точки зрения преимущества этого метода. Итак, преимущества

получения инсулина биосинтетическим путем.

До внедрения в промышленность метода получения инсулина с использованием рекомбинантных микроорганизмов существовал только один способ получения инсулина - из поджелудочных желез крупного рогатого скота и свиней. Инсулин, получаемый из поджелудочной железы крупного рогатого скота отличается от инсулина человека на 3 аминокислотных остатка, а инсулин, получаемый из железы свиньи, только на один аминокислотный остаток, то есть он ближе к человеческому инсулину. Тем не менее, при введении белков, отличающихся по структуре от белков человека даже в таком незначительном выражении, возможно возникновение аллергических реакций. Такой инсулин, как чужеродный белок, также может и инактивироваться в крови образующимися антителами.

Кроме того, для получения 1 килограмма инсулина требуется 35 тысяч голов свиней (если известно, что годовая потребность в инсулине -1 тонна препарата). С другой стороны, биосинтетическим путем можно получить такое же количесвто инсулина, проведя биосинтез в 25 кубовом ферментере, используя рекомбинантный микроорганизм Escherichia coli.

Биосинтетический метод получения инсулина стал применяться в начале 80-х годов (восьмидесятых годов). Остановимся на схеме получения рекомбинантного инсулина (фирма Eli Lilli- Эли-Лилли,

О ТВЕТЫ К СИТУАЦИОННЫМ ЗАДАЧАМ 1 ►

БИОТЕХНОЛОГИЯ ММА им. И.М. Сеченова

В начало | Меню | Программа | Литература | Возврат к предыдущему документу | -4 2 ►

Соединенные Штаты Америки):

1. этап Путем химического синтеза были созданы последовательности нуклеотидов, которые кодируют образование А и В цепей, то есть были созданы синтетические гены.

2. 11 этап. Каждый из синтетических генов вводят в плазмиды (в одну плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь А, в другую плазмиду вводят ген, синтезирующий цепь В).

3. 111 этап. Вводят ген, кодирующий образование фермента бетагалактозидазы. Этот ген включают в каждую плазмиду для того, чтобы добиться бурной репликации плазмид.

Рис.

4. 1У этап. Вводят плазмиды в клетку Escherichia coli - кишечной палочки и получают две культуры продуцента, одна культура синтезирует А-цепь, вторая В-

цепь.

5. V этап. Помещают две культуры в ферментер. В среду добавляют галактозу, которая индуцирует образование фермента бетагалактозидазы. При этом плазмиды активно реплицируются, образуя много копий плазмид и, следовательно, много генов, синтезирующих АиВ цепи.

6. VI этап. Клетки лизируют, выделяют АиВ цепи, которые связаны с бетагалактозидазой. Все это обрабатывают бромцианом и отщепляют А и В-цепи от бетагалактозидазы. Затем производят дальнейшую очистку и выделение АиВ цепей.

7. VII этап. Окисляют остатки цистеина, связывают и получают инсулин.

Инсулин, полученный этим путем является человеческим инсулином по своей структуре. Применение современных методов очистки исключает наличие в инсулине эндотоксинов и пирогенных примесей.