1. Высокоэффективная газовая хроматография Введение

Газожидкостная хроматография как метод разделения основана на распределении компонентов смеси между двумя фазами, из которых газовая является подвижной, а жидкая - неподвижной. В классическом варианте компоненты смеси переносятся подвижной фазой вдоль колонки, заполненной частицами твердого носителя, которые покрыты слоем неподвижной жидкой фазы (НЖФ). В высокоэффективной газовой хроматографии обычно используются колонки без носителя, а пленка НЖФ наносится на внутреннюю поверхность капилляра. Этот тип колонок, предложенный Голеем в 1957 г., обеспечивает более высокую эффективность разделения (до нескольких тысяч тарелок на метр длины) по сравнению с обычными насадочным колонками. В связи с этим и появился термин высокоэффективная газовая (или капиллярная) хроматография, которая применяется для разделения сложных смесей, состоящих из большого числа разнообразных веществ, а также компонентов с близкими физическими и химическими свойствами.

Однако капиллярная хроматография, в которой первоначально применялись хрупкие стеклянные колонки большой длины, долгое время не находила широкого применения в лабораторной практике. Отношение к ней резко изменилось, когда в 1979 г. в компании Hewlett - Packard появились колонки из плавленого кварца, которые благодаря прочности и гибкости более удобны в применении, чем стеклянные. Кроме этого поверхность плавленого кварца более инертна, что уменьшает адсорбцию компонентов на стенках и улучшает функционирование (массоперенос и эффективность) колонок.

В 1983 г. на 2-м Международном симпозиуме по капиллярной хроматографии компания Hewlett - Packard сделала еще один шаг в развитии газовой хроматографии с “открытыми капиллярными колонками” (этот термин эквивалент общепринятому английскому термину “open capillari column”). Впервые были представлены коммерчески выпускаемые колонки большого диаметра как альтернатива насадочным колонкам. Это позволило применять капиллярную хроматографию для анализа легколетучих соединений, сочетать преимущества кварцевых колонок с обычным хроматографическим оборудованием, предназначенным для работы с насадочными колонками, и сделали капиллярную хроматографию более удобной и приспособленной для рутинных анализов.

Область применения высокоэффективной хроматографии непрерывно расширялась и в настоящее время большинство анализов выполняется с использованием капиллярных колонок.

1.1. Особенности капиллярной колонки. Уравнение Голея

Решающим моментом при разработке методики газохроматографического анализа является определение величины степени газохроматографического разделения, необходимой для достижения цели.

Способность хроматографической системы разделять “критическую пару” веществ (два наиболее трудно разделяемых соединения) зависит не только от их абсолютных времен удерживания (т.е. селективности), но и от формы пиков этих соединений, т.е. от эффективности разделительной колонки.

Для насадочных колонок, характеризующихся низкой эффективностью, наибольший вклад в величину разделения вносит селективность, поэтому для такого варианта газовой хроматографии необходим широкий ассортимент неподвижных фаз (НФ). В случае высокоэффективных капиллярных колонок высокая степень разделения достигается с использованием небольшого числа НФ.

Критерием качества разделения смеси двух веществ служит отношение расстояния между максимумами хроматографических пиков к сумме полуширин оснований пиков. Эта величина и называется степенью (коэффициентом) разделения

. (1.1)

Исправленное (приведенное) время удерживание t_R рассчитывается как разность абсолютного времени удерживания t_C и времени удерживания несорбирующегося вещества (“мертвое время”) t_O

t_R = t_C – t_О . (1.2)

Связь между величинами t_O,, t_C и t_R, а также экспериментальное определение коэффициента разделения, иллюстрирует рис. 1. Умножив значения времен удерживания на объемную скорость потока газа-носителя, можно перейти к соответствующим объемным параметрам удерживания V_О, V_C и V_R.

Считается, что практически полное разделение веществ достигается, когда R  1. Коэффициент разделения определяется селективностью и эффективностью работы хроматографической колонки:

, (1.3)

где n – эффективность колонки, выраженная числом теоретических тарелок;  – фактор селективности.

Фактор селективности выражают через относительное удерживание критической пары компонентов пробы:

, (1.4)

где K₁ и K₂ - коэффициенты распределения двух анализируемых веществ между двумя фазами в хроматографической колонке.

Рис. 1. Связь между абсолютным и приведенным временем удерживания и определение критерия качества разделения.

Мерой молярного распределения анализируемого вещества между НФ и газовой фазой служит коэффициент емкости колонки (k). Эта величина определяется экспериментально как отношение времени нахождения компонента в НФ ко времени его нахождения в газовой фазе:

, (1.5)

где n_i,s и n_i,m - число молей компонента i в подвижной и неподвижной фазе соответственно. Коэффициент емкости связан с коэффициентом распределения согласно уравнения:

, (1.6)

где - фазовое отношение, т.е. отношение объема колонки, занятого газовой подвижной фазой (V_m), к объему колонки, занятому НФ (V_s)

. (1.7)

Для открытых капиллярных колонок со слоем НФ на внутренних стенках, имеющих внутренний радиус r, фазовое отношение обратно пропорционально толщине пленки жидкой фазы d_f:

 = r/2d_f . (1.8)

Обычно значения  для капиллярных колонок колеблются в пределах 50 -500, при этом, чем тоньше пленка НФ, тем выше значение .

Эффективность разделения - это мера расширения хроматографической полосы вещества при его прохождении через колонку. Эффективность определяется соотношением времени удерживания вещества и стандартного отклонения его пика. Исходя из допущения о том, что хроматографический пик описывается кривой Гаусса, можно рассчитать эффективность хроматографической кoлонки, выраженную числом теоретических тарелок n:

. (1.9)

Стандартное отклонение пика можно определить по его ширине (рис. 2). Обычно измеряют ширину пика на половине его высоты, поэтому для расчета эффективности колонки, как правило, применяют уравнение

, (1.10)

где 2₂t - ширина пика на половине его высоты.

Рис. 2. Измерение ширины пика на разной высоте и значение стандартного отклонения гауссовского пика.

На практике часто используют удельную эффективность n/L, т.е. число теоретических тарелок приходящихся на метр длины колонки.

Эффективность хроматографической колонки можно также выразить высотой эквивалентной теоретической тарелке (h, или ВЭТТ), - это длина участка колонки в миллиметрах, соответствующая одной теоретической тарелке:

h=L/n . (1.11)

Эффективность колонки тем выше, чем больше число теоретических тарелок n и меньше их высота h.

Если удерживание сорбата выражается через приведенное время или исправленный объем удерживания V_R, то в этом случае по уравнению (1.9) рассчитывают число эффективных теоретических тарелок

. (1.12)

Число эффективных теоретических тарелок связано с числом теоретических тарелок через коэффициент емкости

, (1.13)

где k − емкость колонки.

По аналогии с уравнением (1.11) высота, эквивалентная эффективной теоретической тарелке (H, или ВЭЭТТ), определяется выражением

H = L/N (1.14)

Фундаментальным уравнением, описывающим функционирование насадочной хроматографической колонки и объединяющим диффузионно-массообменную теорию и теорию тарелок, является уравнение Ван-Деемтера. В этом уравнении эффективность колонки представлена как функция линейной скорости подвижной фазы U. В сокращенной форме уравнение Ван-Деемтера имеет вид

, (1.15)

где член A=2d (d - диаметр зерна сорбента,  - коэффициент, определяемый строением и природой частиц) отражает вклад вихревой диффузии и характеризует природу и структуру насадки; член B=2^.D (D - коэффициент молекулярной диффузии сорбата, ^. - коэффициент извилистости) описывает вклад продольной молекулярной диффузии; член С=1/K_m (K_m - константа скорости межфазного массообмена) характеризует сопротивление массообмену.

В открытых капиллярных колонках, которые не содержат насадку (d=0), отсутствует “вихревая” диффузия, поэтому член A равен нулю, а коэффициент извилистости =1. В результате уравнение Ван-Деемтера принимает вид, известный как уравнение Голея

. (1.16)

В уравнении Голея член B_К, характеризующий продольную диффузию, равен 2D. Коэффициент диффузии вещества в газовой фазе можно предсказать по молекулярным массам и объемам компонента и газа носителя. При хроматографировании всегда имеет место продольная диффузия, которая приводит к размыванию пика и тем больше, чем больше коэффициент диффузии и время нахождения сорбата в колонке.

Коэффициент C_К в уравнении Голея, в отличие от уравнения Ван-Деемтера, учитывает не только замедленность массопереноса из газовой фазы в НФ и в обратном направлении, но и так называемую динамическую (или поперечную) диффузию. В капилляре скорость газа изменяется от оси капилляра, где она максимальна, к поверхности стенок капилляра, где U практически равна нулю. Это приводит к тому, что молекулы в движущемся газе опережают молекулы, задерживающиеся в неподвижной пленке газа у стенок, что вызывает дополнительное размывание хроматографической полосы. Это размывание уменьшается с увеличением коэффициента молекулярной диффузии, при котором облегчается обмен молекулами между движущейся частью газа и неподвижной его частью у стенок. Существенно, что размывание, обусловленное такой динамической диффузией, зависит от скорости газа. С увеличением скорости газа размывание возрастает, так как чем больше скорость потока, тем больше отставание от него молекул, попавших в неподвижный слой газа у стенок капилляра.

Согласно диффузионно-массообменной теории размывания хроматографических полос, сложные процессы в насадочной колонке можно характеризовать коэффициентом общей эффективной диффузии D_Э, который является суммой трех коэффициентов диффузии − продольной (D_П), вихревой (D_В) и эквивалентной задержке массообмена (D_М):

D_Э = D_П + D_В + D_М (1.17)

Для капиллярной колонки D_В=0, но необходимо ввести коэффициент динамической диффузии D_Д и рассмотреть его зависимость от скорости потока газа. Для упрощенного учета этого фактора можно принять, что во внутренней части капилляра газ протекает с некоторой определенной скоростью, а часть газа, примыкающая к стенкам капилляра, остается неподвижной.

Время , в течение которого молекулы сорбата смогут продиффундировать от центра капилляра к границе между движущейся частью газа и неподвижной его пленкой у стенок капилляра можно оценить на основании уравнения Энштейна

, (1.18)

где D - коэффициент молекулярной диффузии в газе. Очевидно, что среднее смещение  пропорционально диаметру капилляра d_к, поэтому

  d_к² / D. (1.19)

За это время  молекулы в движущемся газе сместятся вдоль его потока на расстояние

_Д =  U . (1.20)

Это смещение _Д можно связать далее с происходящей в то же время  диффузией молекул газа через границу между подвижным газом и неподвижной его пленкой у стенок капилляра. Это можно сделать также с помощью уравнения Энштейна, введя соответствующий этому процессу коэффициент динамической диффузии D_Д:

_Д²  D_Д^. (1.21)

Объединяя уравнения (1.19) и (1.20), получим

²U²  D_Д (1.22)

или , (1.23)

где K_Д − коэффициент пропорциональности. Следовательно, коэффициент динамической диффузии в капиллярной колонке пропорционален квадрату диаметра колонки, квадрату линейной скорости газа и обратно пропорционален коэффициенту молекулярной диффузии сорбата.

В выражении для общего коэффициента эффективной диффузии D_{Э, кап.} в капиллярной колонке нужно ввести член D для продольной диффузии (в этом случае, как отмечалось выше, =1), член D_Д для динамической диффузии и член D_М для диффузии, эквивалентной задержке массообмена газа с неподвижной фазой:

, (1.24)

где =1/2K_m. Подставив данное выражение для коэффициента эффективной диффузии в уравнение, связывающее две теории неравновесной хроматографии

, (1.25)

получим:

(1.26)

Сопоставляя полученное выражение с уравнением (1.10), видно, что коэффициент C_K определяется не только константой скорости межфазного массопереноса, но и диаметром капилляра и коэффициентом молекулярной диффузии. Очевидно, что размывание хроматографической полосы (увеличение H) быстро растет с увеличением диаметра капилляра. Однако слишком сильное сужение капилляра (при том же перепаде давления газа) приводит к резкому снижению скорости газа U, вследствие чего увеличивается значение H (ввиду роста члена B_K/U). Кроме этого, снижение скорости U ведет к нежелательному увеличению времени анализа. Наряду с этим, с уменьшением диаметра колонки адсорбирующая поверхность стенок или количество нанесенной НЖФ (при сохранении толщины ее пленки) сокращается. Поэтому резко снижается емкость колонки, а количество вводимой в колонку пробы должно быть сильно уменьшено. Это влечет за собой большие трудности, связанные с точной дозировкой малых проб и быстротой их ввода в колонку, а также с детектированием малых концентраций компонентов у выхода из колонки. С учетом приведенных выше факторов оптимальный диаметр капиллярной колонки составляет около 0,3 мм.

Характер зависимости ВЭТТ H от линейной скорости газового потока U для капиллярных колонок аналогичен насадочным колонкам, в том смысле, что имеется оптимальная скорость потока, при которой ВЭТТ имеет минимальное значение. На рис. 3 приведены данные, иллюстрирующие влияние скорости потока и природы газа-носителя на разделение. Величина оптимальной скорости газа-носителя зависит от его вязкости и обычно лежит в пределах 10 - 30 см/с. Максимальная эффективность для азота наблюдается в узком интервале малых линейных скоростей газа-носителя, причем по мере увеличения скорости потока эффективность резко падает. Используя азот в качестве газа-носителя, для достижения наилучшего разрешения приходится жертвовать скоростью анализа. Гелий и водород имеют меньшую вязкость, чем азот, поэтому увеличение скорости газа не вызывает существенного ухудшения разрешения. Область минимума на кривой эффективности для водорода наиболее широкая, причем минимальные значения ВЭТТ достигаются при более высоких скоростях. Однако в серийных анализах предпочтение отдают инертному гелию.

Рис. 3. Кривые эффективности при использовании различных газов-носителей. Условия эксперимента: WCOT - колонка 25 м  0,25 мм, НЖФ OV-101, определяемый компонент н-гептадекан, температура колонки 175 ⁰ С.

В капиллярной хроматографии широкое применение в качестве меры оценки эффективности колонки (кроме ВЭТТ) нашло также число разделений (Trennzahl, или TZ). Число разделений - это число пиков, которые могли бы быть разделены между двумя соседними членами гомологического ряда, различающихся одной СН₂- группой, и рассчитывается по уравнению

. (1.27) Эта величина называется также эффективным числом пиков. Для капиллярной колонки число разделений между пиками нормальных углеводородов C₁₂ и C₁₃ более чем в 3 раза превышает число разделений, полученное в аналогичных условиях на насадочной колонке. Конкретно, на капиллярной колонке между пиками C₁₂ и C₁₃ может быть разделен 21 пик, а на насадочной – менее 6.

Преимущество величины TZ перед другими показателями эффективности состоит в том, что число разделений можно применить для характеристики системы в условиях программирования температуры. Кроме того, величина TZ связана с индексами удерживания Ковача (I). Значение TZ для двух н-алканов рассчитывается по формуле

. (1.28)

Следовательно, если для критической пары соединений известны индексы удерживания, то можно легко рассчитать необходимое значение TZ данной колонки по уравнению (1.28). Например, для разделения двух компонентов с разницей I = 5 требуется колонка с TZ = 19.