Тема 9. Тканевое дыхание

и окислительное фосфорилирование

Вопросы, выносимые для изучения

1. Типы окислительно-восстановительных процессов в организме.

2. НАД- и ФАД-дегидрогеназы. Оксидазы.

3. Дыхательная цепь митохондрий.

4. Окислительное фосфорилирование. Сопряженность окислительного фосфорилирования.

5. Цикл Кребса.

Лабораторная работа № 8

Опыт 1. Обнаружение сукцинатдегидрогеназы в мышечной ткани.

Свежую мышечную ткань (5 г) измельчить, залить 4-кратным объемом дистиллированной воды и тщательно растереть в ступке. Полученную мышечную кашицу отфильтровать через двойной слой марли и многократно промыть дистиллированной водой до тех пор, пока промывные воды не станут бесцветными. Отмытая кашица содержит ферменты, в частности, сукцинатдегидрогеназу.

В пробирку поместить мышечную кашицу, добавить 1 мл янтарной кислоты, 2-3 капли раствора метиленовой сини до слабо-голубого окрашивания, перемешать, закрыть пробкой и инкубировать 10-15 минут при 50⁰С.

Затем открыть пробки, перемешать содержимое каждой пробирки, вновь закрыть и инкубировать в том же режиме еще 10 минут.

Провести визуальные наблюдения. и сделать вывод, учитывая, что метиленовая синь в данном опыте является промежуточным акцептором водорода. Окисленная форма метиленовой сини – голубого цвета, восстановленная – бесцветная.

Опыт 2. Моделирование окислительно-восстановительной цепи.

В пробирку внести 1-2мл 0,005% витамина В₂, добавить 1-2мл HCl(1:1) и 1-2 капли 0,001% метиленовой сини. Раствор окрасился в зеленый цвет. Содержимое пробирки перемешать и отлить равный объем в другую пробирку. В одну пробирку бросить кусочек Zn и обе закрыть пробками. Провести визуальные наблюдения, следя за изменением цвета в пробирках.

Затем пробирки открыть. Содержимое каждой пробирки перемешать и вновь проследить за изменением окраски до ее восстановления.

Сделать вывод и написать модель цепи биологического окисления.

Опыт 3. Обнаружение каталазы.

В две пробирки внести по 0,5-1мл крови (или мочи). Одну из пробирок прокипятить. После охлаждения в обе пробирки добавить по 0,5-1 мл 3% H₂O₂.

Провести визуальные наблюдения, сделать вывод. Написать уравнение реакции

Контрольные задания

1. Теории биологического окисления.

2. Схема и принцип работы дыхательной цепи митохондрий

3. В чем сущность окислительного и субстратного фосфорилирования?

4. Написать уравнения реакций цикла Кребса, которые катализируют дегидрогеназы. Рассчитать энергетическую эффективность.

Тема 10. Обмен углеводов

Вопросы, выносимые для изучения

1. Классификация углеводов.

2. Оптическая изомерия. Таутомерные превращения моносахаридов.

3. Дисахариды, олигосахариды, полисахариды. Особенности строения и свойств. Биологическая роль.

4. Переваривание углеводов.

5. Тканевый обмен углеводов. Анаэробное окисление. Аэробное дихотомическое и апотомическое окисление. Синтез.

Лабораторная работа № 9

Опыт 1. Качественные реакции на сахара.

1. Реакция Троммера

В пробирку внести 1-2мл 1% раствора глюкозы и прилить равный объем 10% NaOH. Содержимое пробирки перемешать и добавить 1-3капли 1% CuSO₄. При этом, образовавшийся осадок растворяется, окрашивая жидкость в голубой цвет. Верхний слой нагреть до кипения. Появление желтого или красного окрашивания свидетельствует о наличии редуцирующих сахаров.

Вывод. Глюкоза является восстанавливающим или невосстанавливающим сахаром (ненужное зачеркнуть)

Написать уравнения реакций

2. Реакция с жидкостью Фелинга.

В пробирку внести 1-2мл 1% раствора глюкозы и добавить равный объем реактива Фелинга. Верхний слой нагреть до кипения.

Провести визуальные наблюдения и сделать вывод.

Опыт 2. Кислотный ступенчатый гидролиз крахмала.

При постепенном гидролизе крахмала образуются декстрины с различной молекулярной массой, которые в реакции с йодом дают различную окраску: милодекстрины - сине-фиолетовую; эритродекстрины – красно-бурую. Ди- и моносахара не окрашиваются йодом.

В пробирку внести 3-5мл раствора крахмала и добавить несколько капель конц. соляной кислоты. Содержимое пробирки перемешать и довести до кипения. Затем на предметное стекло нанести каплю раствора и добавить каплю раствора йода (или Люголя). Отметить окраску. Пробирку еще раз довести до кипения и вновь провести аналогичную реакцию с йодом. Снова кипятить и отбирать пробы до тех пор, пока реакция с йодом будет отрицательна.

Вывод. Написать уравнение реакции полного гидролиза крахмала

Опыт 3. Определение амилолитической активности слюны или мочи.

В восемь пронумерованных пробирок внести по 1 мл 0,9% NaCl (для работы с мочой) или по 1мл Н₂О (для работы со слюной). В первую пробирку добавить 1 мл мочи (или 1 мл разбавленной в 10 раз слюны). Содержимое перемешать и 1 мл полученной смеси перенести из первой пробирки во вторую, из второй в третью, из третьей в четвертую и т.д. Из последней пробирки 1мл вылить. Таким образом разведение фермента в каждой последующей пробирки получилось в два раза меньше, чем в предыдущей. Затем во все пробирки добавить по 2 мл 0,1% крахмала. Содержимое каждой пробирки перемешать путем перевертывания пробирки 3-5 раз и инкубировать при 37⁰С в течение 30 минут. Затем охладить во льду и в каждую пробирку внести по капле йода. Перемешать.

Жидкость окрашивается в желтый, красный и синий цвет. Желтая окраска свидетельствует о полном расщеплении крахмала. Отмечают последнюю пробирку с раствором желтого цвета и рассчитать амилазную активность.

Пример расчета:

Например, последняя пробирка с желтой окраской – четвертая, в которой моча разведена в 16 раз ( а слюна в 160 раз). Тогда, 1/16 мл мочи расщепляют 2 мл 0,1% крахмала, а 1 мл мочи расщепляет х мл крахмала, откуда

1  2 1  2  16

Х = --------- = -------------- = 32

1/16 1

Провести визуальные наблюдения и сделать вывод, учитывая, что амилазная активность мочи в норме от 16 до 64 единиц, а слюны – от 160 до 320 единиц

Наблюдения

Исследуемая жидкость	№№ пробирок и окраска с йодом
	1	2	3	4	5	6	7	8
Моча
Слюна

Опыт 4. Обнаружение сахара в моче.

К 0,5-1мл мочи добавить равный объем жидкости Фелинга. Верхний слой нагреть до кипения.

Провести наблюдения и сделать вывод.

(Сахар в моче можно определить также и по реакции Троммера)

Опыт 5. Обнаружение молочной кислоты в мышечной ткани.

В пробирку внести 2-3 мл 2% фенола и добавить несколько капель 2% FeCl₃ до появления фиолетового окрашивания. Затем в пробирку прилить 0,5-1 мл водного экстракта мышц. В присутствии молочной кислоты жидкость окрасится в желтый цвет. Провести наблюдения и сделать вывод. Написать формулу молочной кислоты

Контрольные задания

1. Написать фрагмент молекулы полисахарида (амилозы, амилопектина, гликогена, целлюлозы), указать тип связи и биологическую роль.

2. В каких отделах ЖКТ происходит переваривание углеводов?

3. Рассчитать энергетическую эффективность окисления (субстрат и тип превращений задается преподавателем)