Тема 12. Обмен белков

Вопросы, выносимые для изучения

1. Белки. Классификация белков. Структуры белковой молекулы.

2. Физико-химические свойства белков. ИЭС и ИЭТ. Электрофорез.

3. Переваривание белков.

4. Тканевый катаболизм белков и аминокислот.

5. Синтез белков. Полноценность белков.

Лабораторная работа № 11

Опыт 1. Качественная реакция на белки. Биуретовая реакция.

Обусловлена наличием пептидных связей в молекуле белка, благодаря которым в щелочной среде с солями меди белок образует цветную комплексную соль (сине-фиолетового цвета)

В пробирку внести 1-2 мл раствора белка и прилить равный объем 10% NaOH. Содержимое пробирки перемешать. Добавить 2-3 капли 1%CuSO₄. Провести визуальные наблюдения и сделать вывод.

Опыт 2. Реакции осаждения белков

1. Осаждение белков сернокислым аммонием)

В пробирку внести 3мл раствора белка, добавить равный объем насыщенного раствора (NH₄)₂SO₄. и перемешать. Через 5 минут отфильтровать выпавшие в осадок глобулины.

В фильтрате остается другой белок – альбумин. Для осаждения альбумина в фильтрат добавить тонко измельченный порошок (NH₄)₂SO₄ до насыщения, т.е. до тех пор, пока новая порция порошка остается нерастворенной. Выпавший в осадок альбумин отфильтровать. С фильтратом провести биуретовую реакцию.

Осадок с фильтра смыть в пробирку небольшим количеством воды (0,5-1мл). С полученным раствором провести биуретовую реакцию.

Сделать вывод о полноте и обратимости осаждения белка.

2. Осаждение белков солями тяжелых металлов.

В две пробирки внести по 1-2мл раствора белка. Добавить по несколько капель 0,5% (СН₃СОО)₂Pb (в первую пробирку) и 10%CuSO₄ (во вторую пробирку). Белки выпадают в осадок.

В каждую пробирку добавить растворы соответствующих солей до растворения осадка. Сделать вывод об обратимости осаждении белка.

3. Осаждение белков трихлоруксусной кислотой (ТХУ)

В пробирку внести 1-2мл раствора белка и добавить 2-3 капли ТХУ. Выпадает осадок белков.

Сделать вывод об обратимости осаждении белка.

Опыт 3. Рефрактометрическое определение общего белка сыворотки крови.

1. Юстировка Перед началом определения белка необходимо убедиться, что прибор настроен (отюстирован). Для этого нужно открыть рабочую камеру, на призму нанести несколько капель дистиллированной воды и осторожно закрыть. Глядя в окуляр, с помощью измерительного винта установить шкалу на деление 1,333 (показатель преломления воды). При этом в рабочем поле должны совместиться граница светотени и точка пересечения диагональных линий. Если этого нет, то не изменяя показания шкалы, добиваются совмещения регулировочным ключом.

2. Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови нужно открыть рабочую камеру, насухо вытереть призму и нанести на нее 1-2 капли раствора исследуемого белка. Осторожно закрыть, чтобы не было пузырьков воздуха в окне и с помощью измерительного винта добиться совмещения границы светотени и точки пересечения диагональных линий.

По шкале отметить значение коэффициента преломления, согласно которому по таблице 2 приложений найти процентное содержание белка. Сравнить полученный результат с нормативными показателями (табл. 1 приложений) и сделать вывод.

Опыт 4. Определение белковых фракций в сыворотке крови.

Приготовить 6 пробирок, обозначив их цифрами 0, 1, 2, 3, 4, 5.

В пробирку № 0 внести 10 мл дистиллированной воды, в пробирки 1, 2, 3, 4 - по 5 мл соответствующих рабочих фосфатных растворов.

В пробирку № 5 внести 0,5 мл сыворотки крови, 0,75 мл дистиллированной воды и 3,75 мл основного фосфатного раствора, закрыть пробкой и перемешать путем перевёртывания ее 5-6 раз, после чего перенести по 0,5мл смеси в пробирки №№ 1, 2, 3, 4 и 1 мл в пробирку № 0.

Содержимое пробирок тщательно, но осторожно перемешать, избегая образования пузырьков воздуха, и через 15 мин определить оптическую плотность (ОП) растворов в пробирках №№ 1, 2, 3, 4 против контроля (№0) на ФЭКе при красном светофильтре в кювете шириной 1см.

Измерения оптической плотности проводят в обратной последовательности, сначала в пробирке № 4, а затем в пробирках № 3, 2 и 1.

Расчет произвести по схеме:

ОП пробирки №1 -- ОП пробирки №2 == ОП альбуминов

ОП пробирки №2 -- ОП пробирки №3 == ОП -глобулинов,

ОП пробирки №3 -- ОП пробирки №4 == ОП -глобулинов,

ОП пробирки №4 == ОП -глобулинов.

Принимая сумму ОП альбуминов и всех глобулиновых фракций за 100%, вычислить содержание каждой фракции в относительных процентах. Зная концентрацию общего белка можно произвести перерасчет в абсолютные величины.

Пример расчета:

ОП пробирки №1 == 0,800; ОП пробирки №2 == 0,400;

ОП пробирки №3 == 0.300; ОП пробирки №4 == 0,200;

тогда

ОП альбуминов == 0,800 - 0,400 == 0,400; ОП -глобулинов == 0,400 - 0,300 == 0,100;

ОП -глобулинов == 0,300 - 0,200 == 0,100; ОП -глобулинов == 0,200;

0,400  100 альбумины ==----------------- == 50 %; 0,800	0,100х100 -глобулины == ---------------- == 12,5 %; 0,800
0,100х100 -глобулины == --------------- == 12,5 % ; 0,800	0,200х100 -глобулины == --------------- == 25 %. 0,800

Рассчитать содержание белковых фракций и белкового коэффициента. Сделать заключение, учитывая, что в норме А/Г находится в пределах 0,9-1,4.

Опыт 5. Определение активности пепсина в желудочном соке.

В две пробирки внести по 0,2 мл желудочного сока. Содержимое одной пробирки прокипятить и охладить. В это время приготовить 2 пробирки с 5мл молочно-ацетатной смеси (молоко + ацетатный буфер с рН=5(1:1)). Все пробирки выдержать 5-10 минут в водяной бане при температуре 37⁰С для выравнивания температуры. Затем перелить молочно-ацетатную смесь в пробирки с желудочным соком, встряхнуть и одновременно включить секундомер. Держа пробирки со смесью наклонно и поворачивая их, следить за стекающей по стенкам смесью. При появлении первых мелких сгустков параказеина секундомер остановить и этот момент отметить как завершение реакции.

Расчет произвести по формуле:

60

Х = -----  5

а

где, Х – количество пепсина, единиц в 1 мл;

60 – время, сек (постоянная величина);

а - время по секундомеру (до начала створаживания), сек;

5 - пересчет на 1 мл желудочного сока.

Сделать вывод, учитывая, что желудочный сок здоровых собак содержит от 5 до 15 единиц пепсина, у здорового человека – 40-80 единиц пепсина (одна единица пепсина примерно равна 0,01мг чистого пепсина).

Опыт 6. Обнаружение мочевой кислоты.

В фарфоровую чашку внести 10мл мочи и выпарить ее на огне. К сухому остатку добавить 1-2 капли конц. HNO₃ и вновь выпарить. Коричнево-красному осадку дать остыть, после чего смочить раствором аммиака. Появление пурпурно-красного окрашивания свидетельствует о наличии мочевой кислоты. Если вместо аммиака остаток обработать 10% NaOH, то обнаружится сине-фиолетовое окрашивание.

Провести визуальные наблюдения и сделать вывод. Написать формулу мочевой кислоты

Опыт 7. Обнаружение креатинина в моче.

В пробирку внести 2-3мл мочи и добавить 1-2 капли 5% нитропрассида натрия и 1-2 капли 10% NaOH. Моча окрашивается в красный цвет, быстро переходящий в желтый, что свидетельствует о наличии креатинина.

Написать формулу креатинина и его биохимическую роль

Опыт 8. Обнаружение креатинина в мышечной ткани.

В пробирку внести 0,5-1 мл водного экстракта мышц и добавить 2-3 капли насыщ. раствора пикриновой кислоты и 2-3 капли 10% NaOH. Содержимое пробирки нагреть. Появление оранжево-красного окрашивания свидетельствует о наличии креатинина.

Провести визуальные наблюдения и сделать вывод.

Опыт 9. Обнаружение белка в моче.

В пробирку внести 1-2мл профильтрованного раствора мочи и осторожно наслоить 0,5-1мл конц. HNO₃. Появление белого кольца на границе соприкосновения двух жидкостей свидетельствует о наличии белка в моче.

Провести визуальные наблюдения и сделать вывод. О чем свидетельствует наличие белка в моче?

Опыт 10. Обнаружение мочевины в моче.

К 2-3мл мочи прибавить равный объем 10% NaNO₂ и 2-3капли 2нHCl. Отметить появление пузырьков газа.

Провести визуальные наблюдения и сделать вывод. Описать роль мочевины в обменных процессах.

Контрольные задания

1. Перечислить незаменимые аминокислоты

2. Написать реакции, доказывающие амфотерность аминокислот

3. Дать понятие ИЭС и ИЭТ.

4. Написать формулу пентапептида, имеющего в своем составе 2 незаменимые аминокислоты, учитывая, что его ИЭС наступает при рН<7.

5. Какой заряд имеет этот пептид в нейтральной среде ?

6. Привести пример реакции дезаминирования, декарбоксилирования и переаминирования аминокислот.

7. Написать уравнение реакции гидролиза аргинина с образованием мочевины.

8. Перечислить ферменты, участвующие в переваривании белков с указанием субстратов