Лабораторна робота №18

Тема: Дослідження бактерій кореневої зони рослин

Мета: Визначити якісний та кількісний склад бактерій кореневої зони рослин

Матеріали й устаткування: ґрунтовий моноліт з рослинами розміром 10х10 см, пінцети, ножиці, часове скло, колби на 250 мл, стерильна водопровідна вода, колби та вода для розведень, пісок, стерильні піпетки на 1 мл, піпетки Мора, стерильні шпателі, розрахункова камера Горяєва, мікроскопи, МПА в пробірці.

Теоретичні положення

Відомо, що чим ближче ґрунт розташовується до кореневої системи рослин, тим більшу кількість бактерій він має. Але особливо багато бактерій безпосередньо на поверхні коріння.

В ґрунті, який прилягає до коренів (ризосфера) додатковим джерелом живлення бактерій є відмираючі клітини епідермісу, кореневі волоски, а також продукти екзосмосу рослин (кореневі виділення). В ризосфері розвиваються такі ж самі форми бактерій. що і в ґрунті, який віддалений від коренів. Як правило, на корінні розвиваються не спороносні палички роду Pseudomonas та мікобактерії.

Бактерії кореневої зони рослин виконують наступні функції:

• є санітарами, очищуючи зону кореня від продуктів метаболізму рослин;

• мінералізують органічні рештки, переводячи ряд елементів живлення в доступну для рослин форму;

• продукують ростові речовини, вітаміни.

Деякі бактерії, які розвиваються в кореневій зоні і безпосередньо на корінні, мають денітрифікуючу здатність і при певних умовах можуть викликати великі втрати азоту з ґрунту, що має негативне значення.

Порядок виконання роботи

1. Підрахувати кількість бактерій в ризосфері методом Красильникова.

Стерильною лопатою підкопують ґрунт під рослинами, стерильним пінцетом добувають та вилучають коріння. Ґрунт, який прилип до коренів, струшують у стерильну чашку Петрі, перемішують і беруть наважку ґрунту 1 г (одночасно беруть наважку для визначення вологості ґрунту). Потім 1 г ґрунту поміщають в 100 мл стерильної водопровідної води і готують ряд розведень: 10^-2, 10^-3, 10^-4.

При поверхневому посіві з одержаних розведень стерильною мікропіпеткою наносять 0,05 мл на поверхню МПА і шпателем досуха втирають в агар. При глибинному посіві з розведень стерильною піпеткою беруть 1 мл суспензії і вносять в стерильну чашку Петрі. Потім додають 15-20 мл охолодженого до 40-45ºС агаризованого поживного середовища.

Колонії, які виросли на агарі, підраховують візуально і під лупою. Для визначення кількості бактерій в 1 г ґрунту при глибинному посіві кількість колоній, що виросли, перемножують на відповідне розведення і ділять на масу абсолютно сухого ґрунту, який міститься в 1 г сирого ґрунту. При поверхневому посіві, для встановлення числа бактерій в 1 мл, кількість колоній на чашці Петрі перемножують на 20.

Для визначення якісного складу бактерій колонії розподіляють за культуральними ознаками. З кожної групи готують препарат і виявляють форму колоній. Для визначення видових ознак з колоній роблять пересів на скошений агар і після очистки культури вивчають її морфологічні та фізіологічні ознаки стандартними методами.

2. Облік ризосферної і кореневої мікрофлори методом послідовних відмивок коренів за Є.З. Теппер.

З викопаних монолітів ґрунту з рослинами стерильним пінцетом і ножицями відбирають 1 г молодих коренів (приблизно однакового діаметру) з прилиплими частками ґрунту (одночасно беруть наважку для визначення вологості ґрунту). Коріння поміщають в колби з 100 мл стерильної водопровідної води і збовтують протягом 2 хвилин. За допомогою стерильного крючка корені дістають із колби і переносять послідовно в другу, третю, четверту, п’яту, шосту, сьому колби, які також містять по 100 мл стерильної водопровідної води. В кожній колбі корені відмивають по 2 хвилини. В останню колбу перед стерилізацією додають 3-5 г піску.

Для якісного аналізу бактерій ризосфери з кожної колби окремо стерильною піпеткою беруть 0,05 мл відмивної води, наносять на поверхню МПА і окремим шпателем втирають досуха. Чашки поміщають в термостат при температурі 28-30ºС на 3-5 діб.

По мірі відмивань коріння чисельність бактерій не зменшується, а в ряді випадків збільшується. При цьому в чашках з перших відмивань багато великих колоній, які представлені спороносними формами. Але надалі кількість бацилярних форм зменшується і збільшується число не спороносних форм роду Pseudomonas та мікобактерій, які часто забарвлені в жовтий чи помаранчевий колір.

Для кількісного аналізу бактерій ризосфери суспензію з першого відмивання додатково збовтують 5 хвилин. Потім з неї готують розведення і роблять поверхневі посіви на МПА. Вміст шести останніх колб зливають разом, готують послідовні розведення і роблять поверхневі посіви на МПА.

Для підрахунку бактерій-зародків в 1 г абсолютно сухого ґрунту ризосфери число колоній на чашці перемножують на 20 (для визначення числа бактерій в 1 мл) і на ступінь розведення, а потім ділять на масу абсолютно сухого ґрунту ризосфери. Кількість ризосферного ґрунту, що потрапила з корінням в першу колбу, знаходять за різницею між першою наважкою і наважкою відмитих коренів. Для цього з кожної порції відмитої води корені дістають, поміщають на фільтрувальний папір для вилучення води і зважують.

Для визначення кількості мікроорганізмів на 1 г коріння число колоній, яке виросло на чашці Петрі, перемножують на 20, ступінь розведення і 600 (6 змивів по 100 мл в кожному) і ділять на масу сирих коренів.

В залежності від задач використовують наступний набір поживних середовищ: м'ясо-пептонний агар з глюкозою (5-10 г глюкози на 1 л МПА), синтетичне середовище Чапека для актиноміцетів, крохмалеаміачний агар.

Результати роботи оформляють у вигляді звіту.

СПИСОК РЕКОМЕНДОВАНОЇ ЛІТЕРАТУРИ

1. Аникеев В. В., Лукомская К. А. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Учеб.пособие для студентов биол. спец. пед. ин-тов. – М.: Просвещение, 1983. –127 с.

2. Асонов Н. Р. Микробиология. – М.: Колос, 2001.- 352 с.

3. Л. Г. Бранцевич и др. Микробиология. Практикум. – К.:Вища школа, 1987.- 200 с.

4. Векірчик К. М. Мікробіологія з основами вірусології: Підручник. – К.: Либідь, 2001 – 312 с.

5. Векірчик К. М. Практикум з мікробіології. Навч. пос. - К.: Либідь,2001 – 144 с.

6. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий /Пер. с англ. Г. П. Мирошниченко – М.: Мир, 1982. – 310 с.

7. Градова Н. Б. и др. Лабораторный практикум по общей микробиологии. – М.: ДеЛи принт, 2001. – 131 с.

8. Емцев Т. В. Шильникова В. К. Микробиология. – М.: Агропромиздат, 1990. –190 с.

9. Заварзин Г. А. Бактерии и состав атмосферы. – М.: Наука, 1984.-193 с.

10. Мармузова Л. В. Основы микробиологии, санитарии и гигиены в пищевой промышленности: Учебник. – М.: ПрофОбрИздат, 2001. – 136 с.

11. Медицинская микробиология./ Под ред. В. И. Покровского.- М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1999 –120 с.

12. Мудрецова- Висс К. А. И др. Микробиология, санитария и гигиена: Учебник для вузов. – М.: Деловая литература, 2001. – 388 с.

13. Б. Я. Нейман. Индустрия микробов. – М.: Изд-во Знание, 1983.- 207 с.

14. Нецепляев С. В., Панкратов А. Я. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых продуктов животного происхождения / Под ред. Е. Н. Соколова.- М.: Агропромиздат, 1990.-224 с.

15. Общая микробиология / Под ред. Проф. А. Е. Вершигоры. – к.: Выща шк., 1988.- 343с.

16. Определитель бактерий Берджи в 2-х т./ Под ред. Дж.Хоулта и др.- М.:Мир, 1997.-432 с.

17. Основы микробиологии, вирусологии и иммунологии: Учебник / Под ред. А. А. Воробьева, Ю. С. Кривошеина. – М.: Мастерство; Высшая школа, 2001. – 224 с.

18. Паников Н. С. Кинетика роста микроорганизмов: Общие закономерности и экологические приложения. – М.: Наука, 1991. –236 с.

19. Панкратов Я. Я., Григоров В. С. Руководство к лабораторным занятиям по микробиологии. Уч.пособие для студ. вузов. – М.: Пищевая пром-сть, 1975. –216 с.

20. Перт Дж. С. Основы культивирования микроорганизмов и клеток / Пер. с англ. Под ред И. Л. Работновой. – М.: Мир, 1978 – 384 с.

21. М. Н. Пименова, Н. Н. Гречушкина, Л. Г. Азова. Руководство к практическим занятиям по микробиологии (малый практикум) / Под ред. Н. С. Егорова.- М.: Изд-во Моск. Ун-та,1971.- 220 с.

22. Практикум по микробиологии. /Под ред. Н. С. Егорова. Уч. пособие. – М.: Изд-во Моск. ун-та, 1976. –307 с.

23. Рубан Е. Л. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas /Отв. Ред. Е. Н. Мишустин. – М.: Наука, 1986. – 200 с.

24. Руководство к практическим занятиям по микробиологии: Практическое пособие / Под ред. Н. С. Егорова – М.: Изд-во Моск. Ун-та, 1983. – 215 с.

25. Сидоров М. А., Корненеева Р. Микробиология мяса и мясопродуктов. – М.: Колос, 2000.-240 с.

26. Слюсаренко Т. П. Лабораторный практикум по микробиологии пищевых производств. (для технол. спец. вузов). – М.: Легк. и пищ. пром-сть,1984.–207 с.

27. Смирнов В. В., Киприанова Е. А. Бактерии рода Pseudomonas. - К.: Наукова думка, 1990-264 с.

28. Смирнов В. В. и др. Спорообразующие аэробные бактерии – продуценты биологически активных веществ – К.: Наук. Думка, 1982 – 279 с.

29. Стейниер Р., Эдельберг Э., Ингрем Дж. Мир Микробов. –т.1, 2, 3.- М.: Мир,1979.

30. Е. З. Теппер, В. К. Шильникова, Г. И. Преверзева. Практикум по микробиологии./ М.: Агропромиздат,1987.-239 с.

31. Функціонування мікробних ценозів грунту в умовах антропогенного навантаження / К. І. Андреюк та ін. – К.: Обереги, 2001. – 240 с.

32. Черкес Ф. К., Богоявленская Л. Б., Бельская Н. А. Микробиология. /Под ред. Ф. К. Черкес. – М.: Медицина, 1987. – 512 с.

33. Г. Шлегель. Общая микробиология: Пер. с нем.. /Под ред. Е. Н. Кондратьевой. – М.: Мир, 1987. – 567 с.