Порядок виконання роботи

1. Ознайомитися з рецептурами різних натуральних і синтетичних живильних середовищ.

2. Приготувати рідке живильне середовище.

1) Солодове (несхмелене пивне) сусло – гарне середовище для деяких молочнокислих і оцтовокислих бактерій, дріжджів, мікроскопічних грибів і інших представників гетеротрофних організмів. Основні компоненти сусла – вуглеводи й азотвмісні речовини.

Несхмелене пивне сусло, що отримують із пивоварного заводу, розбавляють водою до 6-7 за Баллінгом і використовують для культивування багатьох мікроорганізмів. Якщо готове сусло відсутнє, користуються солодовим середовищем, що готують у такий спосіб. Зернівки ячменя пророщують до накльовування, потім висушують їх при температурі 60-70С і мелють на кавовому млині. Нагрівають 1 л води до 50С і, перемішуючи, всипають у неї 250 г меленого солоду. Залишають у воді без нагрівання на 30 хвилин, потім воду нагрівають і підтримують температуру 55-58С. Час від часу з рідини беруть проби на крохмаль (йодна проба). Коли йодна проба покаже повне оцукрювання крохмалю, сусло фільтрують і потім стерилізують тиском ½ атм протягом 30 хвилин (так само стерилізують готове сусло). Варто мати на увазі, що для культивування дріжджів використовують сусло, яке містить 6-8 % цукру, а для молочнокислих бактерій – 8-12 %, тому у суслі потрібно визначити вміст цукру. Сусло стерилізують температурою 115С і тиском 0,5 атм упродовж 30 хв.

2) Картопляне середовище використовується для виділення й культивування спороутворюючих амілолітичних бактерій. Для його готування бульби картоплі ретельно промити, очистити від шкірки і дрібно нарізати. 200 г такої картоплі залити 1 л водопровідної води, прокип'ятити протягом 20-30 хв. Відвар профільтрувати через вату і розлити в судини і простерилізувати (1 годину тиском 1 атм чи 30 хвилин тиском 1,5 атм).

3) Пептонна вода придатна для багатьох організмів. Для її готування до дистильованої води потрібно додати 1 % пептону і 0,5 % кухонної солі. Установити рН 7,2, кип'ятити 30 хвилин, знову перевірити рН. Потім розчин профільтрувати через паперовий фільтр до повної прозорості і стерилізувати протягом 30 хвилин при 120С.

5. Приготувати густе живильне середовище на основі сусла і пептонної води.

Сусло-агар (СА) є прекрасним середовищем для молочнокислих бактерій і дріжджів. Для одержання твердого сусла-агару до пивного сусла додають 2 % агару. Середовище стає однорідним безпосередньо в процесі стерилізації в автоклаві. Якщо необхідно приготовлене середовище відразу розлити у пробірки, його попередньо перед стерилізацією розплавляють на водяній бані.

Для фільтрування агарових середовищ застосовують ватно-марлевий фільтр. Для його готування скляну лійку покрити марлевою серветкою такої величини, щоб кінці серветки були перекинуті через край лійки назовні, потім на марлю покласти шар гігроскопічної вати і змочити фільтр гарячою дистильованою водою. Агаризоване середовище налити на фільтр у гарячому виді. Процес фільтрації вести в нагрітій водяній бані.

6. Приготувати тверде живильне середовище на основі пептонної води (додати агар-агар із розрахунку 2 %).

7. Приготувати середовища для актиноміцетів.

Натуральне середовище – вівсяний агар (г): вівсяне борошно (чи пластивці) – 20; агар 20-25; дистильована вода – 1000 мл; сліди солей FeSO₄ – 0,1; MnCl₂ – 0,1; ZnSO₄ – 0,1. Замість дистильованої води і солей можна використовувати водопровідну воду. Для готування середовища вівсяне борошно (чи пластивці) варять у 1 л води 20 хвилин, фільтрують і доводять об’єм до 1 л. Середовище застосовують для збереження й визначення культуральних, а також морфологічних ознак.

Синтетичне середовище – середовище Гаузе (г): крохмаль розчинний – 20; КNO₃ – 1,0; К₂НРО₄ – 0,5; MgSO₄·7H₂O – 0,5; NaCl – 0,5; FeSO₄ – сліди; рН 7,0-7,4; дистильована вода – 1000 мл.

1. Приготувати індикаторне середовище Ендо.

Диференційно-діагностичним середовищем для виявлення бактерій із групи кишкової палички в природних субстратах є агаризованная середовище Ендо наступного складу, м: пептон – 10; лактоза – 10; К₂НРО₄ – 3,5; NaHSO₃ – 2,5; агар – 150; дистильована вода – 1 л; рН – 7,4. До середовища додається 4 мл 10 %-ного спиртового розчину основного фуксину. Середовище стерилізують тиском 1 атм 15 хвилин і зберігають у темряві.

Бактерії з роду Escherichia на цьому середовищі утворюють малинові колонії з металевим блиском.

2. Підготувати середовища до стерилізації

Після фільтрації живильні середовища розливають в судини (колби Ерленмейєра ємністю 250 мл). Наливати треба не вище 2/3 висоти судини. Посуд заздалегідь ретельно миють, висушують, закривають ватно-марлевими пробками, що охороняє середовище від зараження мікроорганізмами, які знаходяться в навколишньому повітрі. Тому пробки повинні бути досить щільними, з рівномірним розподілом волокон вати. Не можна обертати пробки судин, що будуть стерилізуватися в автоклаві, целофаном чи іншими матеріалами, що не пропускають пару. Пара повинна обов'язково проникати через пробку в судину, інакше середовища не нагріються до потрібної температури і не простерилізуються. Посуд необхідно заздалегідь простерилізувати, якщо налиті в нього середовища стерилізують текучою парою чи тиском не більш 0,5 атм. Якщо ж живильні середовища стерилізують під тиском вище 1 атм, то попередня стерилізація посуду необов'язкова.

Середовище з агаром нагрівають на киплячій водяній бані до повного його розплавлення. Якщо передбачається вирощування мікроорганізмів на скошеному агаризованому середовищі в пробірках, то кожну пробірку заповнюють середовищем не більш, ніж на 1/3. Для розливання живильних середовищ користуються лійкою. Потрібно стежити за тим, щоб край пробірок чи флаконів не був змочений живильним середовищем, тому що ватно-марлеві пробки можуть приклеїтись до скла під час стерилізації і будуть важко вийматися, ускладнюючи процес роботи.

Поверх ватно-марлевої пробки на колби й флакони варто надягти паперові ковпачки й підписати назву живильного середовища та дату її готування.

Щоб середовище не підсихало, його скошують після стерилізації, перед посівом. Для цього пробірки з розплавленим на киплячій водяній бані середовищем установлюють у похилому положенні і дають середовищу застигти. Скошена агаризоване середовище не повинно доходити до ватяної пробки на 4-6 см. Середовище, що призначено для культивування бактерій у чашках Петрі, розливають по 15-20 мл у пробірки більшого об’єму, ніж для скошеного агаризованого середовища чи стерилізують у колбах. В останньому випадку до стерилізації агар не розплавляють.

3. Підготувати для стерилізації 4-5 пробірок із водопровідною водою (9 мл) і колбу із 90 мл водопровідної води.

4. Середовища й воду віддати на стерилізацію.