Порядок виконання роботи

1. Дослідити посіви на косому агарі.

• Вивчити й описати культуральні властивості.

Під час візуального контролю переглядають ріст мікроорганізмів за штрихом на поверхні агаризованого середовища. Якщо ріст за штрихом неоднорідний, культура забруднена. Такий контроль є можливим тільки для культур, здатних рости на поверхні густих середовищ.

Опис росту мікроорганізмів за штрихом передбачає відзначення інтенсивності росту: незначний, помірний, рясний і його особливості: суцільний наліт із рівним чи хвилястим краєм у вигляді ланцюжка ізольованих колоній, дифузійний, пір'ястий, деревоподібний чи ризоїдний.

Характеризують оптичні властивості штриха, його колір, поверхню й консистенцію (рис. 2.13).

В описі колонії та росту мікроорганізмів за штрихом обов'язково вказують склад середовища й вік культури, тому що колонії одного організму на різних середовищах можуть відрізнятися кількома ознаками. Для подальшої роботи залишають культури, ріст яких однорідний на всьому штриху, якщо він неоднорідний – культуру вважають забрудненою і відкидають.

• З метою визначення чистоти культури, а також деяких особливостей морфології і тинкторіальних властивостей кліток мікроорганізмів провести їхній мікроскопічний контроль. Замалювати.

Рис. 2.13 - Ріст мікроорганізмів за штрихом:

1 – суцільний з рівним краєм; 2 - суцільний із хвилястим краєм; 3 – чітко видний; 4 – дифузійний; 5 - пір'ястий; 6 – ризоїдний.

2. Визначити здатність мікроорганізмів використовувати вуглеводи.

• Спочатку приготувати кольоровий ряд (діагностичні середовища з індикатором). Для цього в кілька пробірок із 9 мл стерильного фонового (пептонного) середовища з індикатором і поплавцями додають стерильно 10 %-ні водні розчини вуглеводів із розрахунку 1 %.

• Виконати посів виділених культур на отриманий короткий кольоровий ряд

Середовища з вуглеводами чи спиртами, а також пептонну воду засіяти одночасно 0,1-0,2 мл суспензії кліток досліджуваного мікроорганізму. Якщо діагностичне середовище напіврідке (з агаром), то посів зробити уколом через товщу середовища. Пробірки підписати й помістити в термостат із температурою 37С. Якщо організм розвивається швидко, то результати можна реєструвати через 2-4 доби, а якщо повільно – через 7-10. Візуально відзначити ріст чи його відсутність на усіх використаних середовищах за помутнінням середовища, утворенню плівки чи осаду.

Розвиток мікроорганізмів на середовищах із вуглеводами може супроводжуватися утворенням органічних кислот, альдегідів і газоподібних продуктів. Зміну рН реєструють за кольором індикатора (бромтимолблау в інтервалі рН 6,0-7,6 змінює фарбування від жовтої до синього). Газоутворення виявляють за накопиченням газу в поплавці.

На підставі отриманих результатів, що порівнюють із контрольним середовищем, що не містить вуглеводів, роблять висновок про те, які субстрати використовує досліджуваний організм і чи супроводжується це використання накопиченням кислоти чи утворенням газу.

Результати спостережень із проведених дослідів представити у вигляді таблиці.

3. Дослідити вплив мікроорганізмів на молоко.

У пробірки з молоком зробити посів досліджуваних культур мікроорганізмів, наприклад, в одну – стафілокок, а в іншу – кишкову паличку. Додати декілька крапель індикатора лакмусу чи можна використати синій лакмусовий папірець після закінчення терміну культивування. Результати впливу мікроорганізмів на молоко реєструють після 6-10 діб.

Результати спостережень відобразити в таблиці.

Результати біохімічних досліджень мікроорганізмів

Вид бактерій	Лактоза	Глюкоза	Маніт	Сахароза	Молоко
Staphylococcus aureus
Escherichia coli

4. Дослідити кінцеві продукти розщеплення білка гнильними бактеріями.

Продуктами життєдіяльності мікроорганізмів на доступних джерелах азоту часто бувають аміак, сірководень, індол, нітрити, що полегшує їхню ідентифікацію.

Для вивчення кінцевих продуктів розщеплення білка зробити посів гнильних бактерій (Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bac. mesentericus, Bac. cereus чи ін.) на МПБ чи пептонну воду. Результати спостерігаються на наступному занятті.

• Виявлення аміаку

Після посіву суспензії мікроорганізмів в 8-10 мл стерильного пептонного середовища під ватяну пробку пристосовують вузьку стерильну смужку лакмусового папера так, щоб він не стикався з живильним середовищем. Пробку рекомендується загортати целофаном, щоб уникнути зникнення аміаку. За умов утворення аміаку червоний лакмус синіє.

Утворення аміаку можна виявити також за допомогою реактиву Несслера: у присутності слідів аміаку культуральна рідина забарвлюється в жовтий колір, велика кількість аміаку утворює коричневий осад.

• Виявлення сірководню

Мікроорганізми вирощують у пробірці з МПБ (чи пептонній воді з дріжджовим автолізатом) і смужкою фільтрувального паперу, просоченого насиченим розчином ацетату свинцю. Пробку пробірки загортають целофаном, щоб утруднити зникнення H₂S. Тривалість культивування 7-10 діб. Виділення сірководню виявляють за почорнінням паперу внаслідок утворення сульфіду свинцю.

• Виявлення індолу

Для виявлення індолу можна використати різні середовища: МПБ із триптофаном, казеїнову чи пептонну воду. Індол – кінцевий продукт анаеробного розщеплення амінокислоти триптофану – виявляють після закінчення терміну культивування (3-7 діб) за допомогою якісної реакції з реактивом Ерлиха чи за почервонінням індикаторного папірця, попередньо змоченого гарячим насиченим розчином щавлевої кислоти (метод Мореля). Паралельно проводять якісну реакцію на індол у стерильному середовищі.

5. Дослідити відношення мікроорганізмів до кисню і протеолітичну активність.

Про відношення мікроорганізмів до кисню судять за ростом культури у пробірці з агаровим стовпчиком, якщо посів проведений уколом. Аероби розвиваються у верхній частині уколу – ріст у виді цвяха; факультативні анаероби – рівномірно вздовж усього уколу; анаероби – у нижній його частині.

Для вивчення протеолітичної активності досліджувана бактеріальна культура вноситься методом уколу в пробірку зі стовпчиком МПЖ.

Після закінчення декількох діб при кімнатній температурі спостерігається розрідження желатини різних типів. За характером розрідження встановлюється активність протеаз (швидкість і вид розрідження). Процес розрідження йде зверху, причому різні мікроорганізми дають характерну для них форму розрідження: у формі цвяха, лійки, лантухоподібне, пухирчасте та ін.

6. Визначити каталазну активність мікроорганізмів.

Каталазна активність властива більшості аеробних мікроорганізмів. Для виявлення ферменту каталази на предметне скло бактеріальною петлею нанести мікробну масу (наприклад, культуру кишкової палички) і відразу ж додати краплю 3 %-ного розчину перекису водню. Виділення пухирців кисню вкаже на наявність у мікробів каталази.

Каталаза

H₂O₂ ––––––––– Н₂О + О₂

7. Вивчити оксидазну активність мікроорганізмів.

Декілька крапель суміші (1:1) 1 %-ного спиртового розчину -нафтолу і водного розчину диметил-п-фенілендіаміну наносять на колонії у чашках з агаром. Позитивна реакція: забарвлення колоній у фіолетово-синій колір протягом 30 с.

Після закінчення роботи продезінфікувати посуд, мікробіологічні приналежності.

Оформити роботу у вигляді звіту.