Лабораторна робота № 10

Тема: Методи кількісного обліку мікроорганізмів

Мета: Визначити чисельність мікроорганізмів за методом Коха. Користаючись методом прямого рахунку мікробних клітин у рахункових камерах, визначити їхню чисельність.

Матеріали й устаткування: предметні й покривні стекла, барвники, водяна баня зі штативом, бактеріологічна петля, пінцет, спиртівка, 0,1 % розчин агар-агару, окулярний мікрометр, об'єктивний мікрометр, мікроскоп, освітлювач, чисті і накопичувальні добові культури мікроорганізмів (дріжджі), рахункова камера Горяєва, стерильні пробірки, стерильні піпетки на 10 мл та 1-2 мл, колба зі стерильною водою, спирт 96⁰, зразки ґрунту, стерильні живильні середовища (МПА, СА, вівсяний агар, середовище Гаузе, картопляний агар та ін.), електроплитка, стерильні чашки Петрі, мікробіологічні пробірки зі стерильною водопровідною водою, шпателі Дригальського, піпетки, скляні палички.

Теоретичні положення Метод кількісного обліку мікроорганізмів на твердих середовищах

Метод Коха – найбільш розповсюджений спосіб кількісного обліку мікроорганізмів. Сутність методу полягає в посіві визначеного об’єму досліджуваної суспензії мікроорганізму на тверде середовище в чашки Петрі і наступному підрахунку числа колоній, що виросли. При цьому приймають, що кожна колонія утворюється розмноженням однієї клітини.

Цей метод дозволяє вести облік тільки життєздатних мікроорганізмів. В аналізі беруть стерильно 1 мл суспензії і поміщають у 9 мл стерильної водопровідної води чи фізіологічного розчину, потім роблять ряд послідовних розведень (мал. 2.7).

Рис. 2.7 - Схема готування розведення і посіву суспензії мікроорганізмів

Ступінь розведення перед посівом визначається передбачуваною кількістю мікроорганізмів в зразку. Ґрунт є середовищем заселення великого числа різноманітних мікроорганізмів. У 1 г ґрунту міститься від 1 до 10 млрд. кліток мікроорганізмів.

У лабораторній практиці мікробіології немає універсального живильного середовища, на якому розвивалися б усі ґрунтові мікроорганізми, тому результати загальної чисельності мікроорганізмів за методом висіву навіть на найбільш універсальні живильні середовища виходять заниженими.

Підрахунок чисельності кліток мікроорганізмів у рахункових камерах

Метод кількісного обліку мікроорганізмів за допомогою рахункових камер має обмежене застосування, пов'язане з тим, що в цьому випадку виконується облік усіх кліток мікроорганізмів без їхньої диференціації на живі й мертві клітини. Крім того, рахункові камери можуть бути використані лише для підрахунку щодо відносно великих об'єктів – кліток водоростей, дріжджів, спор, грибів, що можна дослідити методом мікроскопії з об'єктивами 8х-40х.

У випадку рухливості клітин препарат незначно підігрівають (чи додають краплю 0,1 % розчину агар-агару). Фіксація і фарбування препаратів призводить до деяких змін розмірів мікробних кліток.

Рахункова камера Горяєва являє собою товсте предметне скло з нанесеними на ньому поперечними прорізами, що утворюють три поперечно розташовані плоскі площадки (рис. 2.8). Середня площадка подовжнім прорізом розділена навпіл, причому на кожній половині нанесена квадратна сітка. Дві бічні площадки розташовано на 0,1 мм вище за середню. Ці площадки служать для притирання покривного скла. Сітка розділена на визначене число згрупованих великих і маленьких квадратів.

Постійною величиною у всіх сітках є маленький квадрат, сторона якого дорівнює 1/20 мм, площа його 1/400 мм², а об’єм при висоті камери 1/10 мм – 1/4000 мм³ чи 1/4000000 мл. Так називаний великий квадрат складається з 16 малих квадратиків.

Камера Горяєва має площу 9 мм², об’єм камери – 9 мм³ і розбита на 225 великих квадратів (15 рядів по 15 великих квадратів у кожнім ряду).

Підрахунок кліток у камері починають через 3-5 хвилин після заповнення її, коли клітини осіли й розташувалися в одній площині. Підрахунок кліток ведуть звичайно в 10 великих або в 20 малих квадратах, переміщаючи її за діагоналлю. З вихідної суспензії варто приготувати 3-4 кратні розведення.

В

Рис. 2. 8 – Рахункова камера Горяєва:

А – вид зверху; Б – вид збоку; В – вид камери Горяєва з малим збільшенням мікроскопа.