Получение эмбрионов крупного рогатого cкота in vitro для биотехнологических программ Сметанина и.Г., Татаринова л.В., Кириенко к.В., Рябых в.П.

ГНУ Всероссийский НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных РАСХН, Боровск, Россия, e-mail: sme.irina2011@yandex.ru

Суперовуляция и эмбриональные пересадки – хорошо устоявшаяся технология, которая используется для получения свыше 80% эмбрионов, получаемых в мире для коммерческих целей. Альтернативным методом для получения эмбрионов крупного рогатого скота (КРС) является использование незрелых ооцитов, собранных из яичников коров-доноров различного возраста и физиологического статуса. Получение эмбрионов in vitro – более новый и более гибкий подход, хотя он технически более трудный и требует специфического лабораторного опыта и оборудования, которые очень важны для качества получаемых эмбрионов. Техника получения эмбрионов in vitro является привлекательной из-за возможностей получения большого числа эмбрионов КРС по низкой стоимости для трансплантации, для программ по трансгенозу, клонированию и криоконсервации генетических ресурсов, а также для фундаментальных исследований механизмов оплодотворения и эмбриогенеза.

Получение эмбрионов in vitro состоит из трех биологических этапов: in vitro созревания ооцитов (IVM – in vitro maturation); in vitro оплодотворения ооцитов (IVF – in vitro fertilization) и эмбриональной культуры (IVC – in vitro culture).

Целью нашей работы было создание эффективной системы получения эмбрионов КРС путем созревания ооцитов in vitro с использованием отечественных гонадотропных препаратов, последующего их оплодотворения и развития эмбрионов вне организма.

Материалы и методы. Яичники КРС доставляли с мясокомбината и транспортировали в лабораторию в течение 2-3часов при температуре 30єС в фосфатно-солевом буферном растворе Дюльбекко («ПанЭко», Россия) или в 0.9% р-ре NaCl. Ооцит-кумулюсные комплексы (ОКК) выделяли из антральных фолликулов диаметром 2-6 мм методом рассечения. Для дозревания отбирали ОКК 1 и 2 категорий по морфологической классификации de Loos F. et al. (1989). Для созревания ооцитов использовали среду МЕМ-альфа («Sigma», США) с добавлением отечественных гонадотропинов - 1мкг/мл фолликулостимулирующего гормона (ФСГ, «ФСГ-супер», ООО «Агробиомед», ВНИИФБиП с/х жив., Россия), 0.3 ед/мл хорионического гонадотропина человека (хч, Московский эндокринный завод), а также 0.2мМ пирувата натрия («Sigma», США) и 2мМ глутамина («Sigma», США). Ооциты культивировали в 4-х луночных чашках фирмы «Nunc»(Дания) по 25-30 ОКК на лунку в 500 мкл среды при температуре 38,5єС под газовой фазой – 5% CO₂ в воздухе в течение 24 часов.

Созревшие in vitro ооциты отмывали в среде Тироде (Bavister, 1983) c 10мМ буфера HEPES (T-H), дополненной 3г/л свободного от жирных кислот бычьего сывороточного альбумина (БСА, N4919, «Sigma», США) и помещали для совместного инкубирования со сперматозоидами в 500 мкл среды оплодотворения из расчета 10 ОКК на 50мкл среды. Для оплодотворения применяли среду Тироде с 25мМ бикарбоната натрия (Bavister, 1983), дополненную 10 мкг/мл гепарина («Sigma», США) и 6 г/л БСА. В работе использовали замороженную сперму, которую готовили методом «всплывания» (Parrish et al., 1986). Концентрация сперматозоидов в среде оплодотворения составляла 1,5-210⁶/мл. Совместную инкубацию яйцеклеток и сперматозоидов осуществляли в течение 22-24 часов при температуре 38,5С в атмосфере 5% CO₂ в воздухе.

Для оценки способности оплодотворенных ооцитов к дальнейшему развитию in vitro их трижды отмывали в среде Т-Н, а затем помещали на культивирование в микрокапли объемом 50мкл в синтетическую жидкость яйцевода (СЖЯ, SOF- synthetic oviductal fluid, Tervit et al.,1972) без глюкозы с добавлением 1мМ глутамина, 0,33 мМ пирувата натрия, 3 г/л БСА (N3311, «Sigma»,США) и 20%-ной эстральной сыворотки, добавляемой в среду через 42 ч после начала оплодотворения. Эстральную сыворотку получали от коров в первой половине охоты. Культивирование осуществляли в течение 210 ч под газовой фазой 5% СО₂, 5% О₂ и 90% N₂ в увлажненной атмосфере при 38,5єС.

В момент добавления в среду культивирования эстральной сыворотки подсчитывали процент дробящихся эмбрионов, через 144 ч после начала оплодотворения определяли процент морул и ранних бластоцист и в момент завершения культивирования через 210 ч подсчитывали процент бластоцист.

Во все среды добавляли пенициллин/стрептомицин в концентрации 100ед/мкг на 1мл («ПанЭко», Россия).

Для оценки качества оплодотворения яйцеклеток крупного рогатого скота готовили тотальные цитологические препараты по методу Anderson (1978) в модификации Malenko(1994).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Исследования показали, что использование отечественных гонадотропинов для созревания ооцитов КРС, а, именно, препарата «ФСГ-супер» (Боровск, Россия) в концентрации 1 мкг/мл и хорионического гонадотропина (Московский эндокринный завод) в концентрации 0,3 ед/мл, позволяет получать in vitro эмбрионы предымплантационных стадий развития. По нашим данным эффективность ядерного созревания составила в этой системе в среднем 65% (в лучших опытах – 80-90%). В качестве критерия созревания яйцеклетки до стадии МII (метафаза II) использовали визуально определяемое под лупой первое направительное тельце. Процент нормально оплодотворенных яйцеклеток согласно цитологическим препаратам составил 43,3%. До стадии бластоцисты развивалось 17.8% эмбрионов от общего числа ооцитов и 46.6% от числа дробящихся эмбрионов. Стадии вылупления достигает 9,2% эмбрионов от общего числа ооцитов и 24,1% от числа дробящихся.

Следует отметить, что ооциты, созревавшие в предложенной нами культуральной системе, были использованы в нашей лаборатории в работах по клонированию. Разработанная технология позволяет получать 20.3-23.6% клонированных эмбрионов КРС на стадии бластоцисты (Кириенко К.В. и др., 2007).

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что разработанная культуральная система с использованием отечественных гонадотропинов, может использоваться для получения ооцитов, зигот и предымплантационных эмбрионов КРС in vitro для различных биотехнологических программ.

Литература 1. Кириенко К.В. с соавт.// С.-х. биология, 2007, № 4.- С.53-61. 2. Anderson G.B. Advances in large mammalian embryo culture/Methods in Mammalian Reproduction. In : Daniel J.C.Jr(ed).- N.Y. Academic Press.- 1978.- P.273-284. 3. Bavister B.D. et al. Development of preimplantation emdryos of the golden hamster in a defined culture medium// Biol. Reprod., 1983, V. 28.- P.235-247. 4. De Loos F. et al. Morphology of immature bovine oocytes// Gam.Res., 1989, V. 24.- P.197-204. 5. Malenko G.P. An improved method for preparing whole specimens from bovine preimplantation embryos: A technique note// Theriogenology, 1994, V. 41.- P.1207-1210. 6. Parrish J.J. et.al. Bovine in vitro fertilization with frozen-thawed semen// Theriogenology, 1986, V. 25.- P.591-600. 7. Tervit H.R. et al. Successful culture in vitro of sheep and cattle ova// J. Reprod. Fertil., 1972, V. 30.- P.493-497.

PRODUCTION OF BOVINE EMBRYOS IN VITRO FOR BIOTECHNOLOGY PROGRAMS

Smetanina I.G., Tatarinova L.V., Kiriyenko K.V., Ryabykh V.P.

All-Russian Institute of Physiology, Biochemistry and Nutrition of Farm Animals,

Borovsk, Kaluga region, Russia

Production of mammalian embryos in vitro is an essential step in programs on the cloning and transgenesis of animals and the conservation of genetic resources. The aim of this study was to create effective system for production of cattle emdryos in vitro with use russian hormonal preparats. We obtained 17,8% blastocyst from oocytes that matured in certain protein-free medium complemented by 1µg/ml FSH (follicle stimulating hormone, «FSH-super», Agrobiomed, Russia) and 0,3 IU/ml hGC (human chorionic gonadotropin, Russia).

УДК 636.082:612