Журнал неврологии и психиатрии / 2008 / NEV_2008_09_11

Иммунокомпетентные клетки, в том числе лимфоциты, интенсивно изучают в связи с аутоиммунной гипотезой патогенеза шизофрении иммунологи- ческими, биохимическими и морфологическими методами [1—3, 5, 8]. При светооптическом исследовании лимфоцитов больных шизофренией были выявлены так называемые атипичные лимфоциты [13— 15, 18], структура которых, биологическое и клини- ческое значение остаются недостаточно изученными.

© П.Д. Бонарцев, 2008

Zh Nevrol Psikhiatr Im SS Korsakova 2008;108:9:62—68

Целью работы явилось исследование ультраструктуры разновидностей лимфоцитов, в том числе атипичных клеток периферической крови больных шизофренией со статистической оценкой соответствующих критериев.

Материал и методы

Исследование было выполнено в лаборатории клинической нейроморфологии (рук. — Н.А. Уранова) Научного центра психического здоровья РАМН. Отбор, оценка состояния больных и диагностика заболевания проводились сотрудниками Отдела психо-

фармакологии (рук. — М.А. Морозова) и Отдела по изучению эндогенных психических расстройств и аффективных состояний (рук. — проф. Г.П. Пантелеева) этого центра.

Обследовали 60 больных хронически протекающей приступообразно-прогредиентной (параноидной) шизофренией, которые диагностически соответствовали рубрике 295.30 по DSM-IV, что соответствует рубрике F20.02 МКБ-10. Среди больных были 21 женщина и 39 мужчин. Средний возраст больных на момент обследования был 33,6±10,4 года (от 18 до 60 лет), средний возраст к началу болезни — 25,9±9,5 года, средняя длительность болезни составляла 7,8±8,2 года.

Были также исследованы 60 больных в остром психотическом состоянии (острая шизофрения) — мужчин, страдавших приступообразной шизофренией и шизоаффективным психозом (рубрики по MKБ10: F 20.02; F 20.22; F 25). Средний возраст этих больных на момент обследования был 22±3,3 года (16— 33), средний возраст к началу болезни — 19,6±3,8 года (12—34), средний возраст манифестации больных — 21,4±3,2 года (17—34). По отношению к этой группе пациентов в данной статье мы иногда используем обозначение «острые» больные.

В качестве контроля были исследованы клетки периферической крови 31 психически и соматически здоровых соответствующего возраста.

Венозную кровь с гепарином брали у пациентов в стерильную коническую пробирку и выдерживали под наклоном в течение 60 мин. Затем отбирали верхний слой лейкоцитов и центрифугировали 10 мин при 1000 об/мин, отбрасывали плазму, а осадок клеток заливали фиксатором — 2,5% раствором глутаральдегида в 0,1 М фосфатном буфере (ФБ, рН 7,2—7,4), промывали в этом буфере, после чего дофиксировали в 1% растворе четырехокиси осмия в 0,1 М буферном растворе в течение 60 мин. Далее осадок клеток отмывали в буфере и заливали 4% агаром в 0,1М ФБ, выдерживали при 50° 30 мин, охлаждали, извлекали застывший агар с осадком клеток, нарезали на кусочки с последующим осуществлением стандартной процедуры обезвоживания и заливки в эпоксидную смолу. Ультратонкие срезы получали на ультратоме ЛКБ (Швеция), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали и фотографировали в электронном микроскопе фирмы «Филипс» (Нидерланды).

Полученный электронно-микроскопический препарат содержал в достаточном количестве все клетки крови: лимфоциты, эритроциты, гранулоциты, моноциты, тромбоциты, а также макромолекулярные компоненты плазмы крови.

Ультраструктурный анализ и морфометрию клеток проводили на ультратонких срезах. У каждого пациента исследовали 100 лимфоцитов и подсчитывали процентное содержание разных их типов.

Одновременно на мазках крови и на автоматическом анализаторе проводили клинический анализ крови пациентов с традиционным подсчетом количества, процента и среднего объема клеток [6].

Статистический анализ проводили, используя программы в системе Statistica версия 6.0.

Результаты

По данным трансмиссионной электронной микроскопии ультратонких срезов, лимфоциты крови

человека могут быть разделены на несколько подтипов (см. схему на рис. 1).

Прежде всего все лимфоциты могут быть разделены на узкоцитоплазменные (УЛ) и широкоцитоплазменные (ШЛ) клетки с ядром, в котором преобладает компактный хроматин, что характерно для неделящихся лимфоцитов. Среди последних в свою очередь можно четко различать по набору органелл в цитоплазме широкоцитоплазменные с малым коли- чеством органелл, т.е. с ультраструктурными признаками низкой функциональной активации (НШЛ), и широкоцитоплазменные с признаками высокой функциональной активации (увеличенным количеством органелл — ВШЛ). Последние в свою очередь разделяются на лимфоциты с неспецифическими признаками активации (множество митохондрий, лизосом и других органелл), которые мы обозначим как активированные широкоплазменные лимфоциты (АШЛ), широкоцитоплазменные с признаками плазмоцитоидной активации (ПШЛ) и моноцитоидной активации (МШЛ), а также лимфобласты (ЛБ).

УЛ — чаще всего клетки сравнительно малых размеров, ядро равномерно окружено узким поясом цитоплазмы, в которой имеется множество рибосом и полисом, мало митохондрий (0—5), редко находятся лизосомоподобные гранулы, вакуоли и иные органеллы; ядро обычно округлое, иногда со впячиванием, к внутренней ядерной мембране прилежит сравнительно широкий неравномерный пояс компактного гетерохроматина, переходящий в центрально расположенные глыбки, между которыми находится диффузный эухроматин, иногда находится ядрышко (рис. 2).

НШЛ от описанных выше отличаются сравнительно широким равномерным или неравномерным поясом цитоплазмы вокруг ядра, в которой иногда больше органелл (0—9 митохондрий, 0—3 гранулы).

Рис. 2. Узкоцитоплазменный лимфоцит (из крови здорового человека). Ув. 10 000×2.

Рис. 3. Активированный лимфоцит (из крови больного шизофренией). Ув.10 000×2.

АШЛ характеризуются широким поясом или обширной цитоплазмой, окружающей ядро, в которой имеется увеличенное количество органелл — более 10 митохондрий, часто несколько вакуолей, гранул и отдельных элементов гладкого и зернистого эндоплазматического ретикулума (рис. 3).

ПШЛ отличаются наличием в обширной цитоплазме хорошо развитого зернистого эндоплазмати-

Рис. 4. Лимфобласт (из крови больного). Ув. 10 000×2.

ческого ретикулума с увеличенным количеством митохондрий, вакуолей и гранул.

МШЛ имеют округлое, характерное для лимфоцитов ядро, но иногда с более глубокими и широкими впячиваниями, при этом в нем часто заметно уменьшено относительное количество компактного гетерохроматина, а в обширной цитоплазме имеется множество гранул (до 20 и более), вакуолей и митохондрий, обычно более мелких.

ЛБ имеют большое ядро, часто с ядрышком и значительно уменьшенным количеством компактного гетерохроматина, так что оно заполнено главным образом диффузным, рыхлым эухроматином. При этом ядро может быть окружено как не очень широкой, так и обширной (чаще) цитоплазмой с увеличенным количеством органелл — митохондрий, гранул, вакуолей, элементов гладкого и зернистого эндоплазматического ретикулума (рис. 4).

Из-за существенных различий в приготовлении препаратов для электронной и световой микроскопии приведенное выше подразделение лимфоцитов при анализе ультратонких срезов далеко не совпадает с подразделением, принятым в световой микроскопии (малые, средние и большие лимфоциты). Лишь приблизительно по сравнительным размерам клетки и ядра УЛ можно отнести к малым и редко к большим лимфоцитам, НШЛ — к малым и средним, а все активированные лимфоциты и лимфобласты — к большим. Комплекс Гольджи (пластинчатый комплекс) с его продуктами в виде лизосом наиболее развит в активированных клетках и лимфобластах. Количество цитоплазматических отростков сильно варьирует на различных типах лимфоцитов.

Морфометрические измерения показывают, что в УЛ удельный объем цитоплазмы и ядра в норме в

среднем равен 40,7 и 59,3%, в НШЛ — 57,3 и 42,7%, в АШЛ и других активированных формах — 56,7 и 43,3% и с более высоким объемом цитоплазмы.

В табл. 1 дана характеристика популяции лимфоцитов периферической крови в норме и при шизофрении по данным электронной микроскопии.

Из таблицы можно видеть, что при хронической шизофрении имеется достоверно меньший процент УЛ относительно нормы (р<0,001) и острых больных (р<0,001), а последние не отличаются от нормы. При этом в норме данный показатель достоверно выше у женщин (р<0,03). У женщин с хроническим заболеванием уровень УЛ еще ниже по сравнению со здоровыми.

Процент НШЛ достоверно выше при хрониче- ской (р<0,001) и острой шизофрении (р<0,002) относительно нормы. При этом нет различий между муж- чинами и женщинами. Можно также видеть, что у хронически больных мужчин и женщин соответственно процент НШЛ выше нормы.

Процент АШЛ относительно нормы достоверно выше у хронических больных (р<0,02), но ниже у больных острой шизофренией (р<0,03). Вследствие этого у хронически больных значение еще выше (р<0,001). Между мужчинами и женщинами в норме нет различий,

àу хронически больных мужчин значение достоверно выше, чем у женщин (p<0,002). Хронически больные женщины не отличаются от женщин в норме. Хрони- чески больные мужчины имеют процент АШЛ выше,

àпациенты с острой шизофренией — ниже, чем у мужчин в норме.

Определение процента ПШЛ не выявило никаких достоверных различий. Однако тенденция подобна различиям в доле АШЛ.

Процент МШЛ у хронических больных не отли- чается от нормы, а у острых — достоверно ниже (р<0,005). При этом наблюдается достоверное превышение у хронических над острыми больными (р<0,001). Между мужчинами и женщинами у хронически больных нет различия, а в норме процент МШЛ достоверно выше у мужчин (р<0,04).

Процент ЛБ относительно нормы достоверно выше и у хронических, и у острых больных (р<0,001). Между ними нет различия. В норме также нет разли- чия по полу. Однако у хронических больных разница

по полу достоверна и у мужчин показатель выше (р<0,025).

Результаты, представленные в табл. 1, свидетельствуют, что примененное в данной работе подразделение лимфоцитов на указанные типы клеток дает возможность получить характерные для популяций лимфоцитов здоровых лиц и больных шизофренией статистически достоверные различия. Обращает внимание то, что процентное содержание УЛ по сравнению с нормой ниже у хронических больных, но не отличается от нормы у острых. В то же время уровень активированных форм лимфоцитов выше нормы у хронических больных, а по НШЛ и лимфобластам — и у острых больных.

Следует обратить внимание, что, характеризуя разные подтипы лимфоцитов при шизофрении, мы не используем термин «атипичные лимфоциты», который фигурирует в литературе, посвященной шизофрении. Вместе с тем в этом отношении можно согласиться с высказанным мнением [13—15], что к атипичным лимфоцитам следует отнести ЛБ. Это полностью подтверждают результаты настоящей работы, что позволило нам упомянуть ЛБ в схеме, представленной на рис. 1 дважды. Однако если говорить об атипичности вообще, то ее признаки имелись и в других лимфоцитах и клеточных элементах периферической крови (см. рис. 1). В этом аспекте нужно обратить внимание на лимфоциты с деформированным ядром (иногда вплоть до его фрагментации): в самом ядре компактный хроматин часто образует большую однородную электронно-плотную массу. В цитоплазме по всему объему расположены во множестве разнообразные по размеру вакуоли, заполненные гранулярным и нитчатым макромолекулярным материалом. Такие клетки можно считать находящимися в состоянии деструкции (рис. 5). Есть основание полагать, что такие клетки могут находиться в состоянии вирусного поражения (заметим, что они чаще встречаются в крови больных шизофренией по сравнению со здоровыми).

В крови больных шизофренией можно видеть также атипичные формы моноцитов и нейтрофилов, отличающихся от типичных клеток крови содержанием в цитоплазме больших фагосом. Внутри фагосом могут содержаться макромолекулярные гранулы

Рис. 5. Деструктивный лимфоцит (из крови больного). Ув. 10 000×2.

и филаменты, а также эритроциты, тромбоциты и микроорганизмы (рис. 6). Кроме того, в крови больных встречаются бактерии (БК) и между клетками крови (обычно это микроорганизмы типа коккобацилл) (рис. 7).

Таким образом, атипичные клетки, встречающиеся при шизофрении, — это группа клеток, к которым можно отнести ЛБ, ДЛ, ФМ и ФН. Наиболее значимыми из атипичных клеток являются лимфобласты.

Содержание деструктивных лимфоцитов достоверно выше нормы только у больных острой шизофренией (р<0,025), но достоверно выше и по сравнению с хронически больными пациентами (р<0,005). В норме значение у женщин достоверно выше, чем у мужчин (р< 0,05). ФМ достоверно больше нормы как при хронической, так и острой шизофрении (р<0,0001 и р<0,0005), при этом отсутствуют разли- чия по полу. Выявление в крови ФН позволило по-

Рис. 6. Нейтрофил, фагоцитирующий бактерии (из крови больного). Ув. 7000×2.

лучить достоверное превышение (р<0,00001) только у больных острой шизофренией по сравнению с хронической, хотя в обоих случаях они превышают норму, характеризующуюся достоверно более высоким содержанием рассматриваемых клеток у женщин (р<0,04).

Обсуждение

Хорошо известно, что состояние популяции лимфоцитов в периферической крови отражает функцию лимфопролиферативных органов (костного мозга, селезенки, лимфоузлов и внутритканевых лимфати- ческих образований). Есть основание полагать, что количество наименее активных узкоцитоплазменных лимфоцитов отражает потенциальную готовность системы иммунитета реагировать на различные чужеродные антигены и эта популяция, очевидно, содержит недифференцированные лимфоциты различных ти-

Рис. 7. Бактерии около активированного лимфоцита (из крови больного). Ув. 10 000×2.

пов. Более активированные лимфоциты, вероятно, являются выражением реакции лимфоцитов в ответ на иммунологическую стимуляцию, при этом НШЛ относятся к ее начальным этапам. АШЛ, вероятно, демонстрируют неспецифическую активацию, преимущественно по пути Т-лимфоцитов (клеточный иммунитет), а ПШЛ — активацию В-лимфоцитов в сторону плазматических клеток (гуморальный иммунитет). МШЛ — активация, предположительно, в направлении К-лимфоцитов (клеточный иммунитет). И, наконец, ЛБ отражают интенсивность процесса общей пролиферации лимфоцитов в лимфоидной системе, пополняя в организме генерации Т-, В- и К-лимфоцитов в ответ на соответствующие стимулы (клеточный и гуморальный иммунитет) [6].

Представленные в статье данные показывают, что

óздоровых лиц популяция лимфоцитов находится на относительно низком уровне активации, причем у женщин он ниже, чем у мужчин по всем подтипам лимфоцитов.

Óбольных хронической шизофренией наблюдается наибольшая степень активации лимфоцитов крови. Это выражается в том, что достоверно на 24,86% снижен по сравнению с контролем уровень УЛ и соответственно достоверно повышен уровень НШЛ (на 37,32%), АШЛ (на 26,19%) и ЛБ (на 289,29%) (превышение ПШЛ и МШЛ недостоверно). Следует отметить, что сдвиг в сторону повышения уровня АШЛ

óхронических больных происходит преимущественно за счет мужчин, поскольку у женщин он не отли- чается от нормы.

Больные с острой шизофренией по состоянию активации лимфоцитов резко отличаются от хрони- чески больных. По уровню УЛ острые больные досто-

КЛЕТКИ КРОВИ ПРИ ШИЗОФРЕНИИ

верно не отличаются от нормы, уровень НШЛ достоверно превышает норму (на 27,56%), но достоверно снижены уровни АШЛ (на 18,65%) и МШЛ (на 49,75%), и достоверно повышен уровень ЛБ (на 271,43%) (уровень ПШЛ снижен недостоверно).

Обращает внимание обстоятельство, что и у хронических, и у острых больных одинаково повышен по сравнению с нормой уровень ЛБ, различия же касаются других подтипов лимфоцитов. В этом можно усмотреть определенное свойство протекания патологического процесса, характерного для шизофрении. Например, повышенный уровень ЛБ может быть связан с выходом мозговых антигенов через поврежденный гематоэнцефалический барьер [5]. При этом важно подчеркнуть, что ЛБ отнесены к так называемым атипичным лимфоцитам, выявленным при шизофрении еще в 60-е годы прошлого века. Разли- чия по другим подтипам лимфоцитов могут быть как раз обусловлены особенностями острого и хрониче- ского патологического процесса при шизофрении — соотношением гуморального и клеточного иммунитета [5, 7, 8].

Поскольку в настоящей работе в качестве атипичных клеток, кроме ЛБ, рассматриваются ДЛ, а также ФМ и ФН (проявление клеточного иммунитета), то целесообразно обсудить состояние хрониче- ских и острых больных в этом отношении.

Представленные в настоящей работе данные показывают, что по содержанию атипичных клеток крови хронические и острые больные шизофренией существенно различаются. У хронических больных, кроме ЛБ, достоверно повышен по сравнению с контролем уровень ФМ (на 220%), а уровни ДЛ и ФН повышены недостоверно. В то же время у острых больных наблюдается достоверное повышение содержания ДЛ (на 303,45%) и ФМ (на 120%).

Можно предположить, что указанные различия между больными с хронической и острой шизофренией отражают соотношение гуморального и клеточ- ного иммунитета [5, 7, 8].

В настоящей работе на основе ультраструктурного исследования представлена более полная по сравнению с существующей литературой морфофункциональная характеристика популяции лимфоцитов периферической крови здоровых людей и больных шизофренией. В литературе [13, 14] этот вопрос рассматривается в основном на светооптическом уровне. Были выявлены так называемые атипичные лимфоциты в количестве около 20% (при колебаниях от 0 до 65%). В дальнейшем авторы пришли к убеждению, что атипичными лимфоцитами являются клетки типа лимфобластов. В работе М. Кокаi и соавт. [15], также проведенной на светооптическом уровне с применением иммунохимических методов, представлены данные по лимфобластам, наиболее близкие нашим, — 2,8% (3,5% у острых больных шизофренией (n=14=8 м+ 6 ж) и 1,9% у хронических (n=10=6 м+4 ж). У здоровых выявили 0,3% (n=14=6 м+8 ж). Расхождения с нашими данными могут быть связаны с разным количеством обследованных и соотношением мужчин и женщин, а также с методом определения. Значи- тельно более низкое значение у здоровых может быть обусловлено более качественным их отбором. В рабо-

1.Бонарцев П.Д. Ультраструктура лимфоцитов периферической крови больных шизофренией в короткоживущей культуре. Журн невропатол и психиатр 1972;72:5:695—701.

2.Бонарцев П.Д. Электронно-микроскопическое изучение процесса бласттрансформации лимфоцитов периферической крови больных шизофренией в условиях in vitro. Журн неврол и психиатр 1973;73:6:878—885.

3.Бонарцев П.Д. Количественный электронно-микроскопический анализ популяции лимфоцитов периферической крови больных шизофренией. Журн невропатол и психиатр 1976;76:7:1061—1067.

женщин с типичной формой генитального герпеса при проведении эндоваскулярного лазерного облучения крови. Вестн рос ассоц акуш и гинекол 1998;1:17—21.

11.Хесин Я.Е. Размеры ядер и функциональное состояние клеток. М: Медицина 1967;279, 362.

12.Яковлев М.Ю. Эндотоксиновая агрессия как предболезнь или универсальный фактор патогенеза заболеваний человека и животных. Успехи соврем биол 2003;123:1:31—40.

13.Hirata-Hibi M. et al. Stimulated lymphocytes in schizophrenia. Arch Gen Psychiat 1982;39:1:82—87.

логии беременности. Бюл экспер биол 1998;125:2:227—232.

5.Вартанян М.Е. Биологическая психиатрия. М: РМ-Вести1999.

6.Иммунология. Под ред. У. Пола. М: Мир1987;1;1989;3.

7.Коляскина Г.И. Иммунология в психиатрии. В кн.: Руководство по психиатрии. Под ред. А.С. Тиганова. М: Медицина 1999;1:190— 211.

8.Коляскина Г.И. и др. Иммунная система при шизофрении. Сиб вестн психиатр и наркол 2003;27:3:21—24.

Schizophr Res 1993;8:3:257—262.

15.Kokai M. et al. Immunophenotypic studies on atypical lymphocytes in psychiatric patients. Psychiat Res 1998;77:2:105—112.

16.Mazzarello V. et al. Lymphocytes in schizophrenic patients under therapy: serological, morphological and cell sabset findings. Ital J Anat Embryol 2004;109:3:177—188.

17.O’Reilly R.L., Singh S.M. Retroviruses and schizophrenia revisited. Am J Med Genet 1996;67:1:19—24.