Журнал неврологии и психиатрии / 2004 / NEV_2004_05_08

Болезнь Паркинсона (БП) — второе по частоте после болезни Альцгеймера нейродегенеративное заболевание позднего возраста, которое встречается во всех популяциях мира. Его распространенность составляет 2—4% среди лиц старше 65 лет [11, 19]. Актуальность проблемы БП возрастает в связи с неуклонным постарением населения в мире. Согласно последнему прогнозу ВОЗ, в последующие два десятилетия в развитых странах до 20% населения станет старше 65 лет. Это неизбежно приведет к увеличению числа больных паркинсонизмом [12].

Несмотря на более чем 100-летний период исследования БП, до сих пор многие этапы ее патогенеза остаются недостаточно изученными. По мнению большинства исследователей, БП является мультифакторным заболеванием, в развитии которого важную роль играют генетическая предрасположенность и средовые факторы [1, 14, 16, 18]. Среди наиболее значи- мых механизмов, приводящих к гибели клеток черной субстанции при БП, называют окислительный стресс и митохондриальные нарушения [1, 17, 22].

Нарушение энергетического обмена в виде дефицита комплекса I дыхательной цепи митохондрий (NADH-CoQ-редуктазы) в ткани черной субстанции больных БП было выявлено А. Schapira и соавт. в 1989 г.

© Коллектив авторов, 2004

[22]. Авторы установили дефицит активности около 35% от возрастной нормы. В последующем обнаружилось, что снижение активности электронтранспортной цепи митохондрий при БП имеет системный характер: нарушения окислительного фосфорилирования митохондрий были выявлены не только в мозговой, но и в ряде других тканей больных БП — в тромбоцитах [7, 13, 15, 20], лимфоцитах [26], фибробластах [1] и в мышцах [24].

С учетом значимой роли митохондриальной функции в модулировании клинических проявлений БП, а также влияния на окислительное фосфорилирование ряда противопаркинсонических препаратов (L- допа, селегилин и др.) актуальной задачей является мониторинг активности клеточного энергообмена у таких пациентов.

В последние годы благодаря совместным усилиям клиницистов и специалистов в области лабораторной диагностики появился адекватный, относительно простой и малотравматичный количественный цитохимический метод исследования митохондриальных ферментов, достоверно отражающий полисистемное состояние энергетического обмена клеток и тканей [5, 25]. Работы в клинической цитохимии с его использованием показали, что метаболические изменения лейкоцитов крови в значительной степени отражают аналогичные сдвиги в других клетках организ-

ма [2, 3]. Этот метод был применен и в настоящей работе.

Целью исследования были цитохимический анализ нарушений в системе митохондриального окислительного фосфорилирования лимфоцитов у пациентов с БП и определение взаимосвязи этих нарушений с характером течения заболевания.

Материал и методы

В нейрогенетическом отделении Института неврологии РАМН обследовали 75 пациентов с разными формами БП. В контрольную группу вошли 15 клини- чески здоровых людей.

Диагноз БП устанавливался на основании стандартных критериев, предложенных Hoghes и соавт. (1992). Для объективизации выраженности клиниче- ских признаков заболевания применялась унифицированная рейтинговая шкала оценки проявлений паркинсонизма — Unified Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS); базисная оценка тяжести (стадии) БП проводилась по шкале M. Hoehn и M. Yahr в модификации O. Lindvall и соавт. (1988).

На основании результатов комплексного обследования пациенты с БП были разделены на три группы. В группу 1 вошли больные (31 пациент), не полу- чавшие леводопасодержащих препаратов (возраст 63,3±7,8 года). Группу 2 составили пациенты с БП (также 31), получавшие такие препараты (возраст 65,8±8,2 года). Группа 3 включала 13 больных с ювенильной формой БП (возраст 36,6±10,8 года).

использованием светового микроскопа Биолам визуально определяли среднее количество гранул и ориентировочно оценивали изменения их качественных параметров (распределение в клетке, форма, размер, наличие кластеров). На втором этапе у части больных (27) и у 10 здоровых из группы контроля оценивали цитохимическую активность лимфоцитарной СДГ методом компьютерной морфометрии с использованием диагностической системы, состоящей из персонального компьютера со специальным пакетом морфометрических программ «Видео-тест Авто 4.0» (методика В.С. Сухорукова, Е.В. Тозлиян) и светового микроскопа с цифровой камерой. Этот метод, помимо числа гранул формазана в каждой клетке, позволяет определить площадь депозитов, их оптическую плотность и разнородность по оптической плотности (интервал яркости), а также другие параметры организации депозитов в клетке. В связи с локализацией СДГ только в митохондриях геометрические размеры депозитов мы рассматривали как размеры митохондрий, а оптическую плотность депозитов — как интенсивность ферментативной реакции, т.е. активность фермента или функциональную активность митохондрий. Анализ проводили раздельно по гранулам разной площади: мелкие, средние, кластеры. При этом предполагалось, что мелкие гранулы соответствуют мелким митохондриям, средние — крупным, кластеры — конгломератам митохондрий.

При статистическом анализе данных использовали пакет компьютерных прикладных программ STATISTIKA версия 6.0 (StatSoft, 2003). При этом применяли следующие непараметрические методы: анализ связи (корреляции) двух признаков (метод Спирмена), сопоставление двух независимых групп по количественному признаку (U-критерий Манна — Уитни); сравнение двух зависимых (связанных) групп по количественному признаку (критерий Вилкоксона), описательную статистику.

Контрольных групп было две: I — возраст 63,6±4,2 года, II — 30,0±1,1 года). Системная оценка энергетического метаболизма проводилась путем определения в лимфоцитах периферической крови активности ферментов тканевого дыхания: сукцинатдегидрогеназы (СДГ), α-глицерофосфат- дегидрогеназы (α-ГФДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Выбор этих энзимов определялся их ключевой ролью в аэробном и анаэробном энергообеспечении клетки, а также тем, что изменение их активности является маркером митохондриальной дисфункции. Для определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах использовался цитохимический метод Пирса в модификации Р.П. Нарциссова [2], описанный в ряде публикаций [5, 6, 25]. Ферментативную активность выражали в условных единицах, соответствующих среднему числу гранул формазана, являющегося продуктом цитохимической реакции. Оценка нарушений энергетического обмена включала два этапа. На первом рутинным способом с

Результаты

В таблице суммированы данные визуального цитохимического анализа в группах больных и в контроле.

При визуальном анализе гранул формазана в лимфоцитах здоровых 30-летних людей наблюдалась высокая функциональная активность митохондрий. Это выражалось в большом количестве очагов ферментативной активности с относительно равномерным распределением гранул по клетке. С возрастом эта активность снижалась у всех ферментов. Так, средняя активность исследованных ферментов в контрольной группе лиц позднего возраста (63,6±4,2 года) была ниже по сравнению со здоровыми молодыми людьми

— соответственно (в усл. ед.): СДГ — 17,6±1,3 и

19,2±0,5; α-ÃÔÄÃ — 7,2±0,5 è 12,4±1,4; ËÄÃ — 8,8±1,4

è12,4±1,8; ÌÄÃ — 7,0±1,3 è 12,6±1,7; ÃÄÃ — 6,8±0,8

è13,4±1,4. Это подтверждает литературные данные о значительном снижении активности электронтранспортной цепи митохондрий в клетках мозга с увели- чением возраста [8, 9]. При старении уменьшаются тканевое потребление кислорода и интенсивность основных метаболических процессов [23]. Снижение с возрастом митохондриальной активности может объяснять отсроченное начало некоторых нейродегенеративных заболеваний [1].

Óвсех больных c БП были обнаружены значи- тельные нарушения энергетического обмена, проявлявшиеся снижением общего количества гранул формазана в лимфоцитах. Кроме того, у пациентов групп 1 и 2 отмечен дефицит свободно лежащих гранул при одновременном образовании конгломератов (кластеров). Все это указывает на нарушение окислительновосстановительных процессов в митохондриях лимфоцитов крови больных этих групп. Наиболее выраженным снижение количества исследованных энзимов было в группе 2. Следует заметить, что ряд авторов указывают на возможное отрицательное воздействие на функцию митохондрий приема леводопасодержащих препаратов [21]. Следует также учесть, что пациенты в этой группе, как правило, были старше

èхарактеризовались большими продолжительностью болезни и ее тяжестью. Примечательно, что снижение всех показателей активности ферментов у пациентов с ювенильной формой БП (группа 3) было меньшим, чем при БП пожилого возраста (группы 1

è2). Однако по сравнению с возрастной группой контроля у пациентов с ювенильной формой болезни активность всех ферментов была снижена.

Более детальный анализ митохондриальных нарушений был проведен на следующем этапе исследования — с морфометрическим анализом ферментной активности лимфоцитов. Компьютерная морфометрия проводилась на примере СДГ как наиболее диагностически значимого фермента дыхательной цепи митохондрий. СДГ является одним из ключевых ферментов цикла Кребса и в определенном смысле класси- ческим митохондриальным маркером. Ее активность характеризует не только состояние цикла Кребса, но

èв целом уровень активности ферментов дыхательной цепи [4].

Динамика распределения депозитов СДГ в исследованных группах представлена на рисунке.

Активность СДГ в группах 1 и 2 изменялась за счет увеличения числа кластеров (наиболее крупных

èоптически плотных ассоциаций депозитов) соответственно до 31 и 37 при норме 26. Отмечалось также уменьшение содержания отдельно расположенных митохондрий (мелких и средних депозитов) — до 33

è36 при норме 47. Наибольшее количество кластеров, занимающих 31,7 и 37,1% площади всех депозитов (при возрастной норме 26,4%) отмечено также в группах 1 и 2. При этом в обеих группах общее коли- чество депозитов было меньшим (гранулы слипались, становились более однородными, содержали большее количество формазана).

Несколько отличной была динамика в группе 3 (ювенильный паркинсонизм). Активность фермента

изменялась за счет отдельно лежащих митохондрий (мелких депозитов), количество которых было уменьшено до 41 (возрастная норма 46); при этом увеличи- валось их относительное количество по сравнению с остальными депозитами (кластерами и средними). Мелкие депозиты составляли 41,7% от общего коли- чества депозитов в клетке при возрастной норме 47%. При этом возрастала средняя активность фермента в каждой отдельно взятой клетке за счет увеличения оптической плотности до 0,28 усл.ед. (норма 0,26 усл. ед.), а также возрастала интегральная оптическая плотность до 41 усл.ед. (норма 31 усл. ед.). В этой группе пациентов изменения затрагивали и наиболее активно работающие органеллы, объединенные в кластеры: в лимфоцитах пациентов группы 3 их количе- ство возрастало до 35,1% от общего количества депозитов, при этом оптическая плотность увеличивалась до 0,35 усл. ед. при возрастной норме 0,28 усл. ед.

При использовании метода корреляционного анализа была выявлена следующая связь цитохимических параметров с проявлениями БП: 1) активность СДГ у пациентов группы 1 находилась в обратной связи с тяжестью заболевания, оцененной в баллах по шкалам UPDRS (r=–0,53; р=0,002) и Hoehn и Yahr (r= –0,60; р=0,003). Сходные результаты по обеим шкалам получены у пациентов группы 2: r=–0,44, р=0,02 и r=–0,54, р=0,002; 2) у пациентов группы 1 активность СДГ находилась в обратной зависимости от давности заболевания (r=–0,50, р=0,005); 3) у пациентов с ювенильной формой болезни (группа 3) активность митохондриальных ферментов α-ГФДГ, ЛДГ и ГДГ коррелировала с тяжестью болезни по Hoehn и Yahr: соответственно r=0,93, р=0,02; r=0,93, р=0,02; r=0,98, р=0,003.

Обсуждение

В результате исследования установлено, что степень изменения морфометрических параметров активности митохондрий коррелирует с тяжестью и длительностью течения заболевания во всех обследованных группах больных. Выраженные изменения у больных всех групп по сравнению с одновозрастным контролем проявлялись значительным снижением коли- чества гранул и изменением их качественных параметров (увеличение площади средних гранул и кластеров, округление гранул, повышение оптической

Ê 2003.

2.Нарциссов Р.П. Анализ изображения клетки — следующий этап развития клинической цитохимии в педиатрии. Педиатрия 1998; 4: 101—105.

3.Петричук С.В. Влияние естественных и антропогенных физи- ческих факторов на развитие организма: Автореф. äèñ. ...…ä-ðà áèîë. íàóê. Ì 1996.

4.Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия. М: Медицина 2000.

5.Сухоруков В.С., Нарциссов Р.П., Клембовский А.И. и др. Сравнительная диагностическая ценность анализа скелетной мышцы и лимфоцитов при митохондриальных болезнях. Арх пат 2000; 62: 19—22.

6.Шищенко В.М., Петричук С.В. и др. Новые возможности цитохимического анализа в оценке состояния здоровья ребенка и прогнозе его развития. Педиатрия 1998; 4: 96—101.

7.Benecke R., Strumper P., Weiss H. Electron transfer complexes I and IV of platelets are abnormal in Parkinson’s disease but normal in Parkinson-plus syndromes. Brain 1993; 116: 1451—1463.

8.Bowling A.C., Mutisya E. M., Walker L.C. et al. Age-dependent impairment of mitochondrial function in primate brain. J Neurochem 1993; 60: 1964—1967.

9.Chen Y.I., Jenkins B.G., Fink S., Rosen B.R. Evidence for impairment of energy metabolism in Parkinson’s disease using in vivo localized MR spectroscopy. Proc Soc Mag Res 1994; 1: 194—198.

10.Dagani F., Ferrari R., Anderson J.J. et al. L-Dopa does not affect electron transfer chain enzymes and respiration of rat muscle mitochondria. Mov Disord 1991; 6: 315—319.

11.De Rijk M.C., Breteler M.M., Gravelend G.A. et al. Prevalence of Parkinson’s disease in the elderly: the Rotterdam study. Neurology 1995; 45: 445—451.

12.Graeber M.B., Grasbon-Frod I.E., Eitzen U.V., Kosel S. Neurodegeneration and aging: role of the second genome. Neirosci Res 1998; 52: 1—6.

13.Haas R.H., Nasirian F., Nakano K. et al. Low platelet mitochondrial complex I and complex II/III activity in early untreated Parkinson’s disease. Ann Neurol 1995; 37: 714—722.

son’s disease. Neurology 1992; 42: 2241—2250.

15.Krige D., Carroll M.T., Cooper J.M. et al. Platelet mitochondrial function in Parkinson’s disease. Ann Neurol 1992; 32: 782—788.

16.Langston J.W. Current theories on the cause of Parkinson’s disease. J Neurol Psychiat 1989; 52: suppl: 13—17.

17.Mizuno Y., Ohta S., Tanaka M. et al. Deficiencies in complex I subunits of the respiratory chain in Parkinson’s disease. Biochem Biophys Res Commun 1989; 163: 1450—1455.

18.Mizuno Y., Ikebe S., Hattori N. et al. Role of mitochondria in the etiology and pathogenesis of Parkinson’s disease. Biochem Biophys Acta 1995; 1271: 265—274.

19.Moghal S., Rajput A.H., D’Arcy C., Rajput R. Prevalence of movement disorders in elderly community residents. Neuroepidemiology 1994;

13:175—178.

20.Parker W.D.J., Boyson S.J., Parks J.K. Abnormalities of the electron transport chain in idiopathic Parkinson’s disease. Ann Neurol 1989;

26:719—723.

21.Przedborski S., Jackson-Lewis V., Muthane U. et al. Chronic levodopa administration alters cerebral mitochondrial respiratory chain activity. Ann Neurol 1993; 34: 715—723.

22.Schapira A.H.V., Cooper J.M., Dexter D. et al. Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson’s disease. Lancet 1989; 1366: 225—233.

23.Scheffler I.E. A century of mitochondrial research: achievements and perspectives. Mitochondrion 2001; 1: 3—31.

24.Shoffner J.K., Watts R.L., Juncos J.L. et al. Mitochondrial oxidative phosphorylation defects in Parkinson’s disease. Ann Neurol 1991;

30:332—339.

25.Suchorukov V.S., Nartsissov R.P., Petrichuk S.V. et al. Peripheral lymphocytes as a mitochondrial insufficiency test. Eur J Med Res 2000; 31: 48—49.

26.Yoshino H., Nakagawa-Hattori Y., Kondo T., Mizuno Y. Mitochondrial complex I and II activities of lymphocytes and platelets in Parkinson’s disease. J Neural Transm 1992; 4: 27—34.

Поступила 01.09.03