Добавил:
proza.ru http://www.proza.ru/avtor/lanaserova Опубликованный материал нарушает ваши авторские права? Сообщите нам.
Вуз: Предмет: Файл:
Скачиваний:
14
Добавлен:
15.09.2017
Размер:
271.99 Кб
Скачать

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

Цитохимическая активность митохондриальных ферментов при болезни Паркинсона

Е.В. ПОЛЕВАЯ, И.А. ИВАНОВА-СМОЛЕНСКАЯ, С.Н. ИЛЛАРИОШКИН, В.С. СУХОРУКОВ, Е.Д. МАРКОВА

Cytochemical activity of mitochondrial enzymes in Parkinson’s disease

E.V. POLEVAYA, I.A. IVANOVA-SMOLENSKAYA, S.N. ILLARIOSHKIN, V.S. SUKHORUKOV, E.D. MARKOVA

НИИ неврологии РАМН, Московский НИИ педиатрии и детской хирургии МЗ РФ, Москва

В процессе обследования 75 больных с болезнью Паркинсона (БП) и 15 здоровых людей (контроль) с применением цитохимического компьютернo-морфометрического метода оценивалась активность ключевых ферментов энергообмена — сукцинатдегидрогеназы, α-глицерофосфатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы, глутаматдегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в лимфоцитах периферической крови. У всех обследованных, включая больных с ювенильным паркинсонизмом, выявлены признаки митохондриальной недостаточности, степень выраженности которой зависела от тяжести и продолжительности заболевания. Полученные данные могут служить основанием для внедрения в практику метода цитохимического мониторинга течения БП, а также применения современных «митохондриальных» препаратов (янтавит, коэнзим Q10, L-карнитин и др.) для ее лечения.

Ключевые слова: болезнь Паркинсона, митохондрии, ферменты, энергетический метаболизм.

Using cytochemical computerized morphometric method, activity of the key enzymes of energetic metabolism (succinate dehydrogenase, α-glycerophosphate dehydrogenase, malate dehydrogenase, glutamate dehydrogenase and lactate dehydrogenase) was studied in blood lymphocytes of 75 patients with Parkinson’s disease and 15 healthy controls. The signs of systemic mitochondrial insufficiency, which correlated with the disease duration and severity, were found in all the patients, including those with juvenile parkinsonism. These data may provide a basis for introducing cytochemical monitoring as well as for administration of modern “mitochondrial” drugs (yantavit, coenzyme Q10, L-carnitine, etc).

Key words: Parkinson’s disease, mitochondria, enzymes, energetic metabolism.

Zh Nevrol Psikhiatr Im SS Korsakova 2004;104: 5: 42—45

Болезнь Паркинсона (БП) — второе по частоте после болезни Альцгеймера нейродегенеративное заболевание позднего возраста, которое встречается во всех популяциях мира. Его распространенность составляет 2—4% среди лиц старше 65 лет [11, 19]. Актуальность проблемы БП возрастает в связи с неуклонным постарением населения в мире. Согласно последнему прогнозу ВОЗ, в последующие два десятилетия в развитых странах до 20% населения станет старше 65 лет. Это неизбежно приведет к увеличению числа больных паркинсонизмом [12].

Несмотря на более чем 100-летний период исследования БП, до сих пор многие этапы ее патогенеза остаются недостаточно изученными. По мнению большинства исследователей, БП является мультифакторным заболеванием, в развитии которого важную роль играют генетическая предрасположенность и средовые факторы [1, 14, 16, 18]. Среди наиболее значи- мых механизмов, приводящих к гибели клеток черной субстанции при БП, называют окислительный стресс и митохондриальные нарушения [1, 17, 22].

Нарушение энергетического обмена в виде дефицита комплекса I дыхательной цепи митохондрий (NADH-CoQ-редуктазы) в ткани черной субстанции больных БП было выявлено А. Schapira и соавт. в 1989 г.

© Коллектив авторов, 2004

[22]. Авторы установили дефицит активности около 35% от возрастной нормы. В последующем обнаружилось, что снижение активности электронтранспортной цепи митохондрий при БП имеет системный характер: нарушения окислительного фосфорилирования митохондрий были выявлены не только в мозговой, но и в ряде других тканей больных БП — в тромбоцитах [7, 13, 15, 20], лимфоцитах [26], фибробластах [1] и в мышцах [24].

С учетом значимой роли митохондриальной функции в модулировании клинических проявлений БП, а также влияния на окислительное фосфорилирование ряда противопаркинсонических препаратов (L- допа, селегилин и др.) актуальной задачей является мониторинг активности клеточного энергообмена у таких пациентов.

В последние годы благодаря совместным усилиям клиницистов и специалистов в области лабораторной диагностики появился адекватный, относительно простой и малотравматичный количественный цитохимический метод исследования митохондриальных ферментов, достоверно отражающий полисистемное состояние энергетического обмена клеток и тканей [5, 25]. Работы в клинической цитохимии с его использованием показали, что метаболические изменения лейкоцитов крови в значительной степени отражают аналогичные сдвиги в других клетках организ-

42

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 5, 2004

БОЛЕЗНЬ ПАРКИНСОНА

ма [2, 3]. Этот метод был применен и в настоящей работе.

Целью исследования были цитохимический анализ нарушений в системе митохондриального окислительного фосфорилирования лимфоцитов у пациентов с БП и определение взаимосвязи этих нарушений с характером течения заболевания.

Материал и методы

В нейрогенетическом отделении Института неврологии РАМН обследовали 75 пациентов с разными формами БП. В контрольную группу вошли 15 клини- чески здоровых людей.

Диагноз БП устанавливался на основании стандартных критериев, предложенных Hoghes и соавт. (1992). Для объективизации выраженности клиниче- ских признаков заболевания применялась унифицированная рейтинговая шкала оценки проявлений паркинсонизма — Unified Parkinson’s Disease Rating Scale (UPDRS); базисная оценка тяжести (стадии) БП проводилась по шкале M. Hoehn и M. Yahr в модификации O. Lindvall и соавт. (1988).

На основании результатов комплексного обследования пациенты с БП были разделены на три группы. В группу 1 вошли больные (31 пациент), не полу- чавшие леводопасодержащих препаратов (возраст 63,3±7,8 года). Группу 2 составили пациенты с БП (также 31), получавшие такие препараты (возраст 65,8±8,2 года). Группа 3 включала 13 больных с ювенильной формой БП (возраст 36,6±10,8 года).

использованием светового микроскопа Биолам визуально определяли среднее количество гранул и ориентировочно оценивали изменения их качественных параметров (распределение в клетке, форма, размер, наличие кластеров). На втором этапе у части больных (27) и у 10 здоровых из группы контроля оценивали цитохимическую активность лимфоцитарной СДГ методом компьютерной морфометрии с использованием диагностической системы, состоящей из персонального компьютера со специальным пакетом морфометрических программ «Видео-тест Авто 4.0» (методика В.С. Сухорукова, Е.В. Тозлиян) и светового микроскопа с цифровой камерой. Этот метод, помимо числа гранул формазана в каждой клетке, позволяет определить площадь депозитов, их оптическую плотность и разнородность по оптической плотности (интервал яркости), а также другие параметры организации депозитов в клетке. В связи с локализацией СДГ только в митохондриях геометрические размеры депозитов мы рассматривали как размеры митохондрий, а оптическую плотность депозитов — как интенсивность ферментативной реакции, т.е. активность фермента или функциональную активность митохондрий. Анализ проводили раздельно по гранулам разной площади: мелкие, средние, кластеры. При этом предполагалось, что мелкие гранулы соответствуют мелким митохондриям, средние — крупным, кластеры — конгломератам митохондрий.

При статистическом анализе данных использовали пакет компьютерных прикладных программ STATISTIKA версия 6.0 (StatSoft, 2003). При этом применяли следующие непараметрические методы: анализ связи (корреляции) двух признаков (метод Спирмена), сопоставление двух независимых групп по количественному признаку (U-критерий Манна — Уитни); сравнение двух зависимых (связанных) групп по количественному признаку (критерий Вилкоксона), описательную статистику.

Контрольных групп было две: I — возраст 63,6±4,2 года, II — 30,0±1,1 года). Системная оценка энергетического метаболизма проводилась путем определения в лимфоцитах периферической крови активности ферментов тканевого дыхания: сукцинатдегидрогеназы (СДГ), α-глицерофосфат- дегидрогеназы (α-ГФДГ), глутаматдегидрогеназы (ГДГ), малатдегидрогеназы (МДГ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Выбор этих энзимов определялся их ключевой ролью в аэробном и анаэробном энергообеспечении клетки, а также тем, что изменение их активности является маркером митохондриальной дисфункции. Для определения активности дегидрогеназ в лимфоцитах использовался цитохимический метод Пирса в модификации Р.П. Нарциссова [2], описанный в ряде публикаций [5, 6, 25]. Ферментативную активность выражали в условных единицах, соответствующих среднему числу гранул формазана, являющегося продуктом цитохимической реакции. Оценка нарушений энергетического обмена включала два этапа. На первом рутинным способом с

Результаты

В таблице суммированы данные визуального цитохимического анализа в группах больных и в контроле.

При визуальном анализе гранул формазана в лимфоцитах здоровых 30-летних людей наблюдалась высокая функциональная активность митохондрий. Это выражалось в большом количестве очагов ферментативной активности с относительно равномерным распределением гранул по клетке. С возрастом эта активность снижалась у всех ферментов. Так, средняя активность исследованных ферментов в контрольной группе лиц позднего возраста (63,6±4,2 года) была ниже по сравнению со здоровыми молодыми людьми

— соответственно (в усл. ед.): СДГ — 17,6±1,3 и

Активность ферментов энергетического обмена (визуальная оценка)

 

Число

 

Тяжесть

Длитель-

 

Активность ферментов, усл.ед.

 

 

Возраст,

ÁÏ

ность

 

 

Группы

обследован-

 

 

 

 

 

ãîäû

по шкале

болезни,

 

α-ÃÔÄÃ

 

 

 

 

íûõ

ÑÄÃ

ËÄÃ

ÌÄÃ

ÃÄÃ

 

 

UPDRS

ãîäû

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Kонтрольные

 

 

 

 

 

 

 

 

 

I

20

63,6±4,2

17,6±1,3

7,2±0,5

8,8±1,4

7,04±1,3

6,8±0,8

II

15

30,0±1,1

19,2±0,5

12,4±1,4

12,4±1,8

12,6±1,7

13,4±1,4

Основные:

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1

31

63,3±7,8

29,5±13,5

3,7±1,9

11,8±2,0*

4,9±1,1*

7,2±2**

5,2±1,6

4,3±1,4

2

31

65,8±8,2

38,6±16,5

7±3,7

10,35±1,8**

4,1±0,9**

6,9±1,8

5,2±1,6

4,0±1,2

3

13

36,6±10,8

22,0±7,3

8,5±9,0

15,3±2,8*

6,1±1,3

9,2±1,4*

6,1±1,6

6,0±1,6

Примечание. Условные единицы ферментативной активности лимфоцитов соответствуют среднему числу гранул формазана, являющегося продуктом цитохимической реакции. Достоверные различия с контрольной группой аналогичного возраста: * — р<0,05, ** — p<0,01.

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 5, 2004

43

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО-ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ВОПРОСЫ

19,2±0,5; α-ÃÔÄÃ — 7,2±0,5 è 12,4±1,4; ËÄÃ — 8,8±1,4

è12,4±1,8; ÌÄÃ — 7,0±1,3 è 12,6±1,7; ÃÄÃ — 6,8±0,8

è13,4±1,4. Это подтверждает литературные данные о значительном снижении активности электронтранспортной цепи митохондрий в клетках мозга с увели- чением возраста [8, 9]. При старении уменьшаются тканевое потребление кислорода и интенсивность основных метаболических процессов [23]. Снижение с возрастом митохондриальной активности может объяснять отсроченное начало некоторых нейродегенеративных заболеваний [1].

Óвсех больных c БП были обнаружены значи- тельные нарушения энергетического обмена, проявлявшиеся снижением общего количества гранул формазана в лимфоцитах. Кроме того, у пациентов групп 1 и 2 отмечен дефицит свободно лежащих гранул при одновременном образовании конгломератов (кластеров). Все это указывает на нарушение окислительновосстановительных процессов в митохондриях лимфоцитов крови больных этих групп. Наиболее выраженным снижение количества исследованных энзимов было в группе 2. Следует заметить, что ряд авторов указывают на возможное отрицательное воздействие на функцию митохондрий приема леводопасодержащих препаратов [21]. Следует также учесть, что пациенты в этой группе, как правило, были старше

èхарактеризовались большими продолжительностью болезни и ее тяжестью. Примечательно, что снижение всех показателей активности ферментов у пациентов с ювенильной формой БП (группа 3) было меньшим, чем при БП пожилого возраста (группы 1

è2). Однако по сравнению с возрастной группой контроля у пациентов с ювенильной формой болезни активность всех ферментов была снижена.

Более детальный анализ митохондриальных нарушений был проведен на следующем этапе исследования — с морфометрическим анализом ферментной активности лимфоцитов. Компьютерная морфометрия проводилась на примере СДГ как наиболее диагностически значимого фермента дыхательной цепи митохондрий. СДГ является одним из ключевых ферментов цикла Кребса и в определенном смысле класси- ческим митохондриальным маркером. Ее активность характеризует не только состояние цикла Кребса, но

èв целом уровень активности ферментов дыхательной цепи [4].

Динамика распределения депозитов СДГ в исследованных группах представлена на рисунке.

Активность СДГ в группах 1 и 2 изменялась за счет увеличения числа кластеров (наиболее крупных

èоптически плотных ассоциаций депозитов) соответственно до 31 и 37 при норме 26. Отмечалось также уменьшение содержания отдельно расположенных митохондрий (мелких и средних депозитов) — до 33

è36 при норме 47. Наибольшее количество кластеров, занимающих 31,7 и 37,1% площади всех депозитов (при возрастной норме 26,4%) отмечено также в группах 1 и 2. При этом в обеих группах общее коли- чество депозитов было меньшим (гранулы слипались, становились более однородными, содержали большее количество формазана).

Несколько отличной была динамика в группе 3 (ювенильный паркинсонизм). Активность фермента

Распределение депозитов СДГ в исследованных группах

(по результатам компьютерной телеметрии), размер гранул,

выявленных с помощью морфометрической методики.

изменялась за счет отдельно лежащих митохондрий (мелких депозитов), количество которых было уменьшено до 41 (возрастная норма 46); при этом увеличи- валось их относительное количество по сравнению с остальными депозитами (кластерами и средними). Мелкие депозиты составляли 41,7% от общего коли- чества депозитов в клетке при возрастной норме 47%. При этом возрастала средняя активность фермента в каждой отдельно взятой клетке за счет увеличения оптической плотности до 0,28 усл.ед. (норма 0,26 усл. ед.), а также возрастала интегральная оптическая плотность до 41 усл.ед. (норма 31 усл. ед.). В этой группе пациентов изменения затрагивали и наиболее активно работающие органеллы, объединенные в кластеры: в лимфоцитах пациентов группы 3 их количе- ство возрастало до 35,1% от общего количества депозитов, при этом оптическая плотность увеличивалась до 0,35 усл. ед. при возрастной норме 0,28 усл. ед.

При использовании метода корреляционного анализа была выявлена следующая связь цитохимических параметров с проявлениями БП: 1) активность СДГ у пациентов группы 1 находилась в обратной связи с тяжестью заболевания, оцененной в баллах по шкалам UPDRS (r=–0,53; р=0,002) и Hoehn и Yahr (r= –0,60; р=0,003). Сходные результаты по обеим шкалам получены у пациентов группы 2: r=–0,44, р=0,02 и r=–0,54, р=0,002; 2) у пациентов группы 1 активность СДГ находилась в обратной зависимости от давности заболевания (r=–0,50, р=0,005); 3) у пациентов с ювенильной формой болезни (группа 3) активность митохондриальных ферментов α-ГФДГ, ЛДГ и ГДГ коррелировала с тяжестью болезни по Hoehn и Yahr: соответственно r=0,93, р=0,02; r=0,93, р=0,02; r=0,98, р=0,003.

Обсуждение

В результате исследования установлено, что степень изменения морфометрических параметров активности митохондрий коррелирует с тяжестью и длительностью течения заболевания во всех обследованных группах больных. Выраженные изменения у больных всех групп по сравнению с одновозрастным контролем проявлялись значительным снижением коли- чества гранул и изменением их качественных параметров (увеличение площади средних гранул и кластеров, округление гранул, повышение оптической

44

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 5, 2004

 

БОЛЕЗНЬ ПАРКИНСОНА

плотности), что свидетельствует о глубоком наруше-

с классической БП (группы 1 и 2), однако не дости-

нии функции митохондрий.

гала возрастной нормы. В группе больных ювениль-

Наиболее существенные изменения обнаружены у

ным паркинсонизмом заболевание цитохимически

пациентов, получавших препараты леводопы. Можно

проявлялось уменьшением прежде всего числа отдель-

предположить, что такие результаты обусловлены от-

но лежащих митохондрий, а также их площади и по-

рицательным влиянием леводопы на функцию мито-

вышением оптической плотности. При этом наибо-

хондрий. Помимо обсуждаемого в литературе токсиче-

лее активные митохондрии объединялись в конгло-

ского влияния леводопы на окислительное фосфори-

мераты с увеличением оптической плотности (при-

лирование [7, 10, 21], следует учесть, что пациенты

мерно на 50% по сравнению с отдельно лежащими

группы 2 в подавляющем большинстве были старше и

депозитами).

имели большие давность болезни и ее тяжесть. У паци-

Полученные данные свидетельствуют о глубоком

ентов группы 2 оказалось достоверным абсолютное

нарушении функции митохондрий и о системной де-

снижение количества митохондрий при относитель-

компенсации энергетического обмена у больных всех

ном повышении процесса кластерообразования — па-

трех групп. Результаты проведенного цитохимическо-

тологического скопления большого количества гранул

го исследования, несмотря на некоторые особенно-

(митохондрий). Конгломераты митохондрий компен-

сти распределения активности митохондриальных

саторно разрастались с одновременным повышением

ферментов в отдельных группах, свидетельствуют об

ферментативной активности в каждой отдельной ми-

общности патогенетических механизмов развития пер-

тохондрии за счет увеличения оптической плотности

вичного паркинсонизма в пожилом и в молодом воз-

депозитов. Подобные процессы наблюдались и у паци-

расте. Наше исследование еще раз доказывает, что

ентов группы 1, но были менее выражены.

нарушения митохондриальной функции являются

Несколько отличные по выраженности, но каче-

одним из ключевых звеньев в патогенезе БП. Полу-

ственно аналогичные изменения энергетического об-

ченные в нем данные могут служить основанием для

мена прослеживались в группе 3. Следует заметить,

рекомендации внедрения в практику нового эффек-

что у этих пациентов была особая форма первичного

тивного метода цитохимического мониторинга тече-

паркинсонизма — ювенильный (юношеский), имею-

ния болезни, а также для назначения при рассматри-

щий ряд характерных клинических и морфологиче-

ваемом заболевании лекарственных средств, влияю-

ских признаков [1]. Ферментативная активность лим-

щих на разные уровни энергетического метаболизма

фоцитов крови у больных ювенильным паркинсониз-

и функционирование электронной цепи митохонд-

мом была несколько более высокой, чем у пациентов

рий (янтавит, коэнзим Q10, L-карнитин и др.).

ЛИТЕРАТУРА

1.Иллариошкин С.Н. Конформационные болезни мозга. М: Янус14. Jenner P., Schapira A.H., Marsden C.D. New insights into the Parkin-

Ê 2003.

2.Нарциссов Р.П. Анализ изображения клетки — следующий этап развития клинической цитохимии в педиатрии. Педиатрия 1998; 4: 101—105.

3.Петричук С.В. Влияние естественных и антропогенных физи- ческих факторов на развитие организма: Автореф. äèñ. ...…ä-ðà áèîë. íàóê. Ì 1996.

4.Северин Е.С., Алейникова Т.Л., Осипов Е.В. Биохимия. М: Медицина 2000.

5.Сухоруков В.С., Нарциссов Р.П., Клембовский А.И. и др. Сравнительная диагностическая ценность анализа скелетной мышцы и лимфоцитов при митохондриальных болезнях. Арх пат 2000; 62: 19—22.

6.Шищенко В.М., Петричук С.В. и др. Новые возможности цитохимического анализа в оценке состояния здоровья ребенка и прогнозе его развития. Педиатрия 1998; 4: 96—101.

7.Benecke R., Strumper P., Weiss H. Electron transfer complexes I and IV of platelets are abnormal in Parkinson’s disease but normal in Parkinson-plus syndromes. Brain 1993; 116: 1451—1463.

8.Bowling A.C., Mutisya E. M., Walker L.C. et al. Age-dependent impairment of mitochondrial function in primate brain. J Neurochem 1993; 60: 1964—1967.

9.Chen Y.I., Jenkins B.G., Fink S., Rosen B.R. Evidence for impairment of energy metabolism in Parkinson’s disease using in vivo localized MR spectroscopy. Proc Soc Mag Res 1994; 1: 194—198.

10.Dagani F., Ferrari R., Anderson J.J. et al. L-Dopa does not affect electron transfer chain enzymes and respiration of rat muscle mitochondria. Mov Disord 1991; 6: 315—319.

11.De Rijk M.C., Breteler M.M., Gravelend G.A. et al. Prevalence of Parkinson’s disease in the elderly: the Rotterdam study. Neurology 1995; 45: 445—451.

12.Graeber M.B., Grasbon-Frod I.E., Eitzen U.V., Kosel S. Neurodegeneration and aging: role of the second genome. Neirosci Res 1998; 52: 1—6.

13.Haas R.H., Nasirian F., Nakano K. et al. Low platelet mitochondrial complex I and complex II/III activity in early untreated Parkinson’s disease. Ann Neurol 1995; 37: 714—722.

son’s disease. Neurology 1992; 42: 2241—2250.

15.Krige D., Carroll M.T., Cooper J.M. et al. Platelet mitochondrial function in Parkinson’s disease. Ann Neurol 1992; 32: 782—788.

16.Langston J.W. Current theories on the cause of Parkinson’s disease. J Neurol Psychiat 1989; 52: suppl: 13—17.

17.Mizuno Y., Ohta S., Tanaka M. et al. Deficiencies in complex I subunits of the respiratory chain in Parkinson’s disease. Biochem Biophys Res Commun 1989; 163: 1450—1455.

18.Mizuno Y., Ikebe S., Hattori N. et al. Role of mitochondria in the etiology and pathogenesis of Parkinson’s disease. Biochem Biophys Acta 1995; 1271: 265—274.

19.Moghal S., Rajput A.H., D’Arcy C., Rajput R. Prevalence of movement disorders in elderly community residents. Neuroepidemiology 1994;

13:175—178.

20.Parker W.D.J., Boyson S.J., Parks J.K. Abnormalities of the electron transport chain in idiopathic Parkinson’s disease. Ann Neurol 1989;

26:719—723.

21.Przedborski S., Jackson-Lewis V., Muthane U. et al. Chronic levodopa administration alters cerebral mitochondrial respiratory chain activity. Ann Neurol 1993; 34: 715—723.

22.Schapira A.H.V., Cooper J.M., Dexter D. et al. Mitochondrial complex I deficiency in Parkinson’s disease. Lancet 1989; 1366: 225—233.

23.Scheffler I.E. A century of mitochondrial research: achievements and perspectives. Mitochondrion 2001; 1: 3—31.

24.Shoffner J.K., Watts R.L., Juncos J.L. et al. Mitochondrial oxidative phosphorylation defects in Parkinson’s disease. Ann Neurol 1991;

30:332—339.

25.Suchorukov V.S., Nartsissov R.P., Petrichuk S.V. et al. Peripheral lymphocytes as a mitochondrial insufficiency test. Eur J Med Res 2000; 31: 48—49.

26.Yoshino H., Nakagawa-Hattori Y., Kondo T., Mizuno Y. Mitochondrial complex I and II activities of lymphocytes and platelets in Parkinson’s disease. J Neural Transm 1992; 4: 27—34.

Поступила 01.09.03

ЖУРНАЛ НЕВРОЛОГИИ И ПСИХИАТРИИ, 5, 2004

45

Соседние файлы в папке 2004