
- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Vmax·[s]
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Приобретённые энзимопатии
В качестве примеров приобретённых энзмопатологий можно рассмотреть пищевые и токсические энзимопатии. К пищевым энзимопатиям можно отнести различные авитаминозы, поскольку для работы многих ферментов необходимы витамины, которые являются составной частью фермента. При недостаточном поступлении с пищей того или иного витамина нарушается работа соответствующего фермента. Это, в свою очередь проявляется клинически. Например, такое заболевание как пеллагра связано с отсутствием в пище витамина РР – никотиновой кислоты. Отсутствие или недостаток никотиновой кислоты в пище приводит к нарушению синтеза коферментов дегидрогеназ (NAD и NADF) и соответственно – к нарушению окисления основных субстратов биологического окисления. Наиболее характерными признаками авитаминоза РР, то есть пеллагры являются поражения кожи (дерматиты), поражения желудочнокишечного тракта (диарея) и нарушения нервной деятельности (деменция).
К токсическим энзимопатологиям можно отнести, например, отравление таким ядом, как цианистый калий. Синильная кислота и её соли, в том числе и цианистый калий обладают способностью связывать железо важнейшего дыхательного фермента – цитохромоксидазы. Выход из строя этого фермента приводит к почти мгновенной смерти.
Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
В качестве лекарственных средств, в клинической практике ферментные препараты используют для возмещения дефицита ферментов, возникающего при некоторых заболеваниях, а также в качестве агентов, специфически разрушающих продукты обмена веществ в организме больного. Особенно успешна заместительная терапия протеолитическими ферментами при нарушениях функций ЖКТ, связанных с недостаточной выработкой пищеварительных ферментов. Например, в клинике часто применяют препараты пепсина при некоторых формах гастрита или панкреатина (смеси пищеварительных ферментов поджелудочной железы) – при заболеваниях, вызванных недостаточной продукцией этих ферментов. С успехом применяют ферменты в тех случаях, когда лечение требует разрушить накопившиеся в большом количестве белковые образования, мешающие нормальному функционированию тканей. Это бывает, например, при ожогах, гнойных ранах, гнойно-воспалительных заболеваниях лёгких, когда в бронхах скапливается густая масса, препятствующая прохождению воздуха и.т. В таких случаях в качестве лекарства применяют протеолитические ферменты, приводящие к быстрому гидролизу белков и способствующие рассасыванию гнойных скоплений. Протеиназы расщепляют в основном некротические массы денатурированных белков и практически не действуют на нативные. Энзиматический лизис является методом избирательного удаления нежизнеспособных тканей. Такое направленное действие протеиназ объясняется тем, что в живых тканях находятся специфические ингибиторы, тормозяшие действие ферментов. В связи с этим высокоочищенные кристаллические препараты протеиназ используются как эффективные противовоспалительные средства. Например, трипсин и химотрипсин успешно применяют при лечении заболеваний дыхательных путей (бронхиты, бронхиальная астма и др.), а также в офтальмологии и стоматологии.
Ферменты применяют также для растворения сгустков (тромбов) в крови, образовавшихся внутри кровеносных сосудов. Поскольку основа тромба – фибрин, то действие ферментов – протеолитическое. Таким действием обладают плазмин (содержится в крови), некоторые ферменты плесневых грибов и бактерий, а также ферменты поджелудочной железы – трипсин и химотрипсин. На основе некоторых из этих ферментов созданы лекарственные препараты – стрептокиназа, стрептаза и др., успешно применяемые в клинике.
Фермент аспарагиназу применяют при лечении такого злокачественного новообразования как лимфогранулёматоз. Этот фермент разрушает аспарагин, являющийся незаменимым фактором для лейкозных клеток, так как они не способны его синтезировать. В результате в раковых клетках возникает дефицит аспарагина и они погибают.
Лечебное применение имеют и некоторые ферменты, гидролизующие сложные полисахариды, – лизоцим, гиалуронидаза. Эти ферменты повышают проницаемость тканей и клеточных мембран, что оказывает противовоспалительное действие. Препараты лизоцима, кроме того, разрушают оболочку некоторых болезнетворных бактерий и используются для лечения ряда инфекционных заболеваний.
В настоящее время клиническая энзимология уверенно развивается как важная составляющая часть клинической лабораторной медицины.