- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Vmax·[s]
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
Практическое использование достижений энзимологии можно найти во всех областях деятельности человека. Ферменты используются в лёгкой, пищевой, микробиологической, фармацевтической промышленности, а также в генноинженерных исследованиях и биотехнологии. Успехи энзимологии находят всё большее применение в медицине.
Медицинская энзимология – новое направление энзимологии, которая имеет свои цели и задачи, специфические методологические подходы и методы исследований.
Медицинская энзимология развивается по трём направлениям:
1. Энзимодиагностика, которая в свою очередь развивается по двум путям:
а) применение высокоочищенных ферментов в качестве избирательных реагентов для количественного определения (с диагностической целью) нормальных или аномальных химических веществ в биологических жидкостях (моча, кровь, желудочный сок и др.);
б) обнаружение (открытие) самих ферментов при поражении органов и тканей.
2. Изучение таких болезней, причина которых лежит в отсутствии или недостаточности тех или иных ферментов – энзимопатологии или энзимопатии.
3. Энзимотерапия – использование ферментов и регуляторов активности ферментов в качестве лекарственных препаратов.
Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
Дифференцировка клеток на органы и ткани сопровождается биохимическими изменениями в них. В результате таких изменений каждый орган и ткань имеют специфический белковый (в том числе ферментный) состав. Многие ферменты широко распространены в разных тканях, но в различных количествах. По увеличению активности таких ферментов трудно судить о локализации первичных патологических изменений, это неспецифические ферменты. Есть и такие ферменты, которые активны только в одном или нескольких органах и фактически отсутствуют во всех других. Это органоспецифические ферменты, они наиболее информативны, так как увеличение их активности свидетельствует о поражении соответствующих органов. Например, известно всего два фермента, которые находятся только в одном органе – в печени – это орнитинкарбамоилтрансфераза (КФ 2.1.3.3) и урокиназа (КФ 4.2.1.49). Для двух органов специфичны гистидаза (КФ 4.3.1.3) – в печени и эпидермисе, трансамидиназа (КФ 2.1.4.1.) – в почках и поджелудочной железе, креатинкиназа (КФ 2.7.3.2) – в сердечной и скелетной мышцах, гунидинацетат-метилтрансфераза (КФ 2.1.1.2) – в печени и поджелудочной железе. Кислая фосфатаза (КФ 3.1.3.2) очень активна в предстательной железе и малоактивна (до 10% от максимума) в других органах.
Ферменты сыворотки крови
Большинство ферментов находится во внутриклеточной среде (в цитоплазме и органеллах). Тем не менее, о скорости синтеза ферментов и об интенсивности выхода из клеток можно судить по их активности в биологических жидкостях (кровь, слюна, ликвор и др.). Наиболее важным в диагностическом процессе является исследование ферментов плазмы крови. Ферменты, которые обнаруживаются в норме в плазме или в сыворотке крови условно можно разделить на три группы: секреторные, индикаторные и экскреторные. Секреторные ферменты синтезируются в печени, в норме выделяются в плазму крови, где играют определённую физиологическую роль. Например, это ферменты, участвующие в процессе свёртывания крови. Индикаторные (клеточные) ферменты попадают в кровь из тканей, где они выполняют определённые внутриклеточные функции (например, лактатдегидрогеназа, альдолаза и др.). Уровень их сывороточной активности зависит от содержания энзимов в тканях, молекулярной массы, внутриклеточной локализации, прочности связи фермента со своей органеллой, а также от скорости гидролитического разрушения и элиминации. Большая часть индикаторных ферментов в норме определяется в сыворотке крови лишь в следовых количествах. При поражении тех или иных тканей ферменты из клеток «вымываются» в кровь, их активность в сыворотке резко возрастает и таким образом, является индикатором степени и глубины повреждения этих тканей. Клеточные ферменты принято делить на неспецифические и органоспецифические (см. выше). Экскреторные ферменты образуются пищеварительными железами и из их секретов поступают в кровь. К ферментам этой группы можно отнести амилазу, липазу, трипсин и др.
Существует другая классификация сывороточных ферментов, по которой их делят на функциональные и нефункциональные. Функциональные ферменты – те ферменты, которые в норме постоянно циркулируют в крови человека и выполняют физиологические функции. К ним относят, например, проферменты компонентов свёртывающей и противосвёртывающей систем крови. Эти ферменты синтезируются в печени, их концентрация в крови такая же, как в тканях, или более высокая. Нефункциональные ферменты плазмы известных физиологических функций в крови не выполняют, их субстраты в плазме не обнаруживаются. Активность нефункциональных ферментов в норме в крови очень мала. Например, это ферменты, выделяемые эндокринными железами: панкреатическая амилаза и липаза, щелочная фосфатаза (из желчи), кислая фосфатаза (из предстательной железы). Причинами появления нефункциональных ферментов в плазме крови являются нормальные процессы разрушения клеток (эритроцитов, лейкоцитов и др.) и удаление ферментов из внеклеточной жидкости путём инактивации и деградации или экскреции.