Методы для изучения механизма действия ферментов

В настоящее время существуют различные экспериментальные подходы для выяснения механизма действия ферментов, к ним относят:

1. физические методы, например, рентгеноструктурный анализ, метод ядерно-магнитного резонанса и др.;

2. химические методы, например, кинетические исследования (вариации концентрации субстрата), модификация структуры субстрата и кофактора, обратимое ингибирование, вариации рН и др.;

3. сайт-специфический мутагенез – это изменение структуры фермента за счёт направленной мутации (см. лекцию 5.1).

Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов

Специфичность – особая способность фермента осуществлять выбор субстрата данной структуры из большой совокупности близких по строению веществ. Ферменты обладают высокой специфичностью действия. Это свойство существенно отличает их от неорганических катализаторов. Высокая специфичность ферментов обусловлена конформационной и электростатической комплементарностью между молекулами субстрата и фермента и уникальной структурной организацией активного центра, что обеспечивает «узнавание», высокое сродство и избирательность протекания одной какой-либо реакции из тысячи других, осуществляющихся одновременно в живых клетках.

В зависимости от механизма действия различают 3 вида специфичности действия ферментов: относительная, абсолютная и стереохимическая.

Относительная или групповая специфичность действия

Относительной (или групповой) специфичностью обладают большинство ферментов, участвующих в процессе пищеварения. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин в одинаковой степени расщепляет белки животного и растительного происхождения несмотря на то, что эти белки существенно отличаются как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет ни углеводы, ни жиры. Объясняется это тем, что точкой приложения, местом действия пепсина является пептидная – СО – NH-связь. Три другие важные эндопептидазы, (сериновые протеазы вырабатываемые поджелудочной железой): трипсин, химотрипсин и эластаза, участвующие в переваривании белков, также являются типичными примерами ферментов с относительной специфичностью. Следует отметить, что субстратная специфичность трипсина ограничена разрывом только тех пептидных связей, в образовании которых участвуют карбоксильные группы лизина и аргинина. Химотрипсин обладает более широкой субстратной специфичностью, чем трипсин. Он катализирует гидролиз не только пептидов, но и эфиров, амидов и других ацилпроизводных, хотя наибольшую активность химотрипсин проявляет по отношению к пептидным связям, в образовании которых принимают участие карбоксильные группы ароматических аминокислот: фенилаланина, тирозина и триптофана. Эластаза обладает широкой субстратной специфичностью, но предпочтительнее гидролизует пептидные связи, образованные аминокислотами с небольшими гидрофобными радикалами, в частности глицином, аланином и серином. Интересно, что ни трипсин, ни химотрипсин не гидролизуют пептидные связи молекулы эластина (эластин содержится в соединительной ткани и характеризуется наличием большого числа остатков глицина и серина), хотя все три фермента, включая эластазу, содержат сходные участки аминокислотных последовательностей и одинаковые места положения дисульфидных мостиков, а также имеют в активном центре один и тот же ключевой остаток серина. Высказано предположение, что все эти три эндопептидазы возможно имеют один и тот же общий предшественник и что специфичность активного фермента в основном определяется конформационными изменениями профермента в процессе активирования.