- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Vmax·[s]
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Диагностическое значение снижения ферментативной активности
Нужно отметить, что не всегда повышение активности фермента в сыворотке крови отражает тяжесть заболевания. Бывает так, что на наличие заболевания указывает не повышение, а наоборот, снижение ферментативной активности. Так, например, острое повреждение клеток при вирусном гепатите может сопровождаться очень высоким подъёмом активности ферментов, которая падает по мере выздоровления. В то же время, при циррозе печень может быть значительно сильнее вовлечена в патологический процесс, но активность ферментов в сыворотке будет либо незначительно повышена, либо находиться в пределах референтных величин, или же будет ниже нормы. Снижение активности ферментов при циррозе и при других тяжёлых заболеваниях печени может быть обусловлено тем, что при циррозе скорость повреждения клеток печени ниже, чем при других острых заболеваниях и, следовательно, снижается скорость выхода ферментов в сыворотку. Кроме этого, при циррозе имеет место глубокое нарушение способности печени синтезировать белки. Например, при циррозе печени в сыворотке крови резко снижается активность фермента холинэстеразы (ХЭ, ложная холинэстераза). Этот фермент синтезируется в печени, легко переходит в кровь и поэтому его активность в плазме высока. Но при некоторых тяжёлых заболеваниях печени активность ХЭ резко снижается. Это указывает на нарушение способности печени синтезировать белки и служит признаком тяжёлого цирроза. Таким образом, любые результаты по активности ферментов в сыворотке крови должны быть обязательно сопоставлены с другими лабораторными анализами и с клинической картиной заболевания.
Неспецифическое повышение ферментативной активности
При интерпретации результатов анализа следует иметь ввиду, что повышение активности ферментов в сыворотке может быть неспецифическим, то есть может быть связано с наличием неспецифического физиологического или патологического процесса. Так, например, тяжёлая физическая работа, массивные внутримышечные инъекции могут привести к повышению активности КК. Некоторые лекарственные средства, в частности фенобарбитал могут индуцировать синтез микросомального фермента гаммаглутамилтрансферазы (ГГТ) и вызвать его повышение в сыворотке без всякого заболевания. Активность ферментов в сыворотке может меняться в результате агрегации с образование макромолекул, например, при образовании комплексов с иммуноглобулинами, в которые вступают ЛДГ, ЩФ и КК.
Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
Высокоочищенные ферменты часто используют в качестве избирательных реагентов для количественного определения (с диагностической целью) нормальных или аномальных химических веществ в биологических жидкостях (моча, кровь, желудочный сок и др.). Так, например, фермент уреазу используют для измерения количества мочевины в моче или в крови. Уреаза – это фермент с абсолютной специфичностью, под её действием мочевина распадается на углекислоту и аммиак:
О ║ |
|
|
уреаза |
|
|
|
NH2 ─С ─NH2 |
+ |
H2O |
→ |
2NH3 |
+ |
CO2 |
мочевина |
|
|
|
аммиак |
|
|
Достаточно обработать пробу крови или мочи раствором уреазы и определить количество образовавшегося аммиака, чтобы точно сказать, сколько мочевины содержалось во взятой пробе.
Также в лабораториях широко используют очень простой и точный метод определения глюкозы в крови и моче с помощью фермента глюкозооксидазы. Принцип метода основан на специфическом окислении глюкозы под влиянием глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4), обладающий высокой субстратной специфичностью по отношению к глюкозе.
D-Глюкоза |
|
D-глюконовая кислота |
О ║ C─H Н─C─ОH ОH─C─Н Н─C─ОH Н─C─ОH СН2ОН |
глюкозооксидаза |
CООH Н─C─ОH ОH─C─Н Н─C─ОH Н─C─ОH СН2ОН |
Этот метод позволяет определить содержание глюкозы в крови в присутствии других восстанавливающих веществ. Глюкозооксидаза – флавопротеин, простетической группой которого является FAD+. Окисление глюкозы глюкозооксидазой происходит у первого углеродного атома до глюконовой кислоты через промежуточный продукт δ-глюконолактон. Перенос двух атомов водорода на FAD+ приводит к его восстановлению, а затем FADH2 передает их на кислород с образованием перекиси водорода в эквимолярных количествах. Образовавшийся пероксид водорода определяется по реакции окислительной конденсации хлорпроизводного фенола с 4-аминофеназоном, катализируемой пероксидазой. Интенсивность возникшей окраски прямо пропорциональна концентрации глюкозы.
Обнаружение самих ферментов при поражении органов и тканей
В настоящее время известно более 30-ти ферментов, активность которых в крови увеличивается при повреждении клеток различных органов в период острого или хронического заболевания. Определение активности большинства из этих ферментов в сыворотке крови используется для диагностики многих заболеваний и контроля за лечением (табл. 5.2.1).
Таблица 5.2.1
Некоторые ферменты, используемые в клинике для диагностики
Фермент |
Локализация в клетке |
Заболевания, при которых фермент наиболее активен в крови |
Аланинаминотрансфераза |
Цитозоль |
Гепетиты, цирроз |
Аспартатаминотрансфераза |
Цитозоль, митохондрии |
Инфаркт и другие заболевания сердца, гепатиты, заболевания почек |
Амилаза |
Цитозоль |
Острый панкреатит |
Креатинкиназа(изоферменты) |
Цитозоль, митохондрии |
Инфаркт миокарда, заболевания скелетных мышц |
Лактатдегидрогеназа(изоферменты) |
Цитозоль |
Инфаркт миокарда, гепатиты, рак печени |
γ-глутамилтранспептидаза |
Цитоплазматическая мембрана |
Гепатиты, цирроз, алкогольное поражение печени |
Липаза панкреатическая |
Цитозоль |
Острый панкреатит, рак поджелудочной железы |
Кислая фосфатаза (рН 4,9) |
Лизосомы |
Метастазирующая карцинома предстательной железы, аденома предстательной железы |
Щелочная фосфатаза (рН 10,0) (изоферменты) |
Плазматическая мембрана |
Заболевания костей, цирроз и новообразования печени, закупорка протоков печени |
Фермент |
Локализация в клетке |
Заболевания, при которых фермент наиболее активен в крови |
Глутаматдегидрогеназа |
Митохондрии |
Острые гепатиты (некротические формы), печёночная кома |
Лейцинаминопептидаза |
Цитозоль |
Цирроз, гепатит, рак поджелудочной железы |
5`-нуклеотидаза |
Плазматическая мембрана |
Механическая желтуха, цирроз, метастазы в печени |
Сорбитолдегидрогеназа |
Цитозоль |
Гепатиты, желтухи |
Псевдохолинэстераза |
Цитозоль |
Нефроз, сахарный деабет IIтипа, алкоголизм |
Гистидаза |
Цитозоль |
Поражения печени |