Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
Рассмотрим механизм действия гидролаз на примере такой гидролазы, как карбоксипептидаза А.
Карбоксипептидаза А (КПА) – пищеварительный фермент, вырабатывается в поджелудочной железе в виде неактивного предшественника – прокарбоксипептидазы А, которая превращается в активный фермент под действием трипсина. Фермент действует как на низкомолекулярные субстраты, так и на белки. Типичные низкомолекулярные субстраты – карбобензоксиглицил-L-фенилаланин и карбобензоксиглицил-L-триптофан. В полипептидах карбоксипептидаза А гидролизует С-концевую пептидную связь. Особенно легко гидролизуются пептиды, в которых С-концевой остаток имеет ароматическую или большую алифатическую боковую цепь (рис. 3.2.1). Фермент не действует на концевые аминокислотные остатки, если они представлены основными аминокислотами или пролином.
Рис. 3.2.1. Реакция, катализируемая карбоксипептидазой А
Этот фермент интересен в том отношении, что по механизму катализа он принципиально отличается от лизоцима. Прежде чем перейти к подробному обсуждению механизма действия карбоксипептидазы А, отметим два основных аспекта.
1. Индуцированное соответствие. Связывание субстрата сопровождается значительными изменениями структуры фермента.
2. Смещение электронов. В активном центре фермента содержатся атом цинка и другие группы, которые индуцируют перераспределение электронов в субстрате, облегчая тем самым процесс гидролиза.
Трехмерную структуру карбоксипептидазы А (рис. 3.2.2) при разрешении в 0,2 нм получил в 1967 г. Уилльям Липском (W. Lipscomb).
Рис3.2.2 Трехмерная структура карбоксипептидазы А. Показаны только α-углеродные атомы и ион цинка (заштрихованный кружок в центре)
Фермент содержит одну полипептидную цепь из 307 аминокислот, имеет компактную форму, которую можно приближенно описать как эллипсоидную с размерами 5х4,2х3,8 нм. В ферменте имеются области α-спиралей (38%) и β-складчатых слоев (17%). С белком прочно связан ион цинка, наличие которого необходимо для проявления ферментативной активности. Ион цинка расположен в углублении близко к поверхности молекулы, причем он образует координационные связи (в виде тетраэдра) с боковыми цепями двух гистидинов, боковой цепью глутамата и молекулой воды (рис. 3.2.3).
Рис. 3.2.3. Ион цинка, расположенный в активном центре карбоксипептидазы А, образует координационные связи с боковыми цепями двух гистидинов и глутамата. Занимающая 4-ю координационную связь молекула воды здесь не показана
Рядом с ионом цинка на ферменте имеется большого размера «карман», в который попадает боковая цепь концевого остатка пептидного субстрата.
Связывание субстрата карбоксипептидазой а
Связывание субстрата индуцирует большие структурные изменения активного центра карбоксипептидазы А. Представление о характере связывания субстратов с карбоксипептидазой А возникло на основе данных, полученных при изучении структуры комплекса этого фермента с глицилтирозином. Глицилтирозин – медленно гидролизуемый субстрат. Процесс его связывания (рис. 3.2.4 и 3.2.5) можно представить в виде пяти последовательных этапов.
1. Отрицательно заряженная концевая карбоксильная группа глицилтирозина вступает в электростатическое взаимодействие с положительно заряженной боковой цепью аргинина-145.
2. Субстрат через боковую цепь своего тирозина связывается в неполярном кармане фермента.
3. Водород NН-группы той пептидной связи, которая должна гидролизоваться, соединяется водородной связью с ОН-группой ароматической боковой цепи тирозина-248.
4. Карбонильный кислород той же пептидной связи вступает в координационную связь с ионом цинка.
5. Концевая аминогруппа субстрата образует водородную связь через вклинивающуюся молекулу воды с боковой цепью глутамата-270. Это взаимодействие, вероятно, не имеет места в случае реакционноспособного ЕS-комплекса, и именно оно, возможно, является причиной крайне медленного гидролиза глицилтирозина.
Рис. 3.2.4. Схематическое изображение связывания глицилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А. Показан постулированный каталитически активный комплекс.
Рис. 3.2.5. Пространственное расположение глицилтирозина в активном центре карбоксипептидазы А. Глицилилтирозин (субстрат) изображен красным
Связывание глицилтирозина сопровождается структурной перестройкой активного центра (рис. 3.2.6). В сущности, только присоединив субстрат каталитические группы фермента принимают правильную ориентацию – положение, впервые постулированное Кошландом (Koshland) в его модели индуцированного соответствия. Гуанидиниевая группа аргинина-145, а также карбоксильная группа глутамата-270 перемещаются на 0,2 нм. Связывание карбонильной группы субстрата с ионом цинка вытесняет из связи с цинком молекулу воды. По крайней мере ещё четыре молекулы воды вытесняются из неполярного кармана на ферменте при связывании с ними тирозиновой боковой цепи в молекуле субстрата. Самое большое изменение конформации – это перемещение фенольного гидроксила тирозина-248 на 1,2 нм, то есть на расстояние, составляющее около 1/4 диаметра молекулы. Такое перемещение осуществляется в первую очередь, путем свободного вращения относительно одинарной связи -С-С- и состоит, что гидроксильная группа тирозина-248, бывшая на поверхности молекулы, перемещается, оказываясь вблизи пептидной связи субстрата. В результате закрывается полость активного центра и тем самым завершается превращение ее из области, заполненной водой, в гидрофобную. Все эти структурные изменения инициируются, по-видимому, связыванием аргинина-145 с концевой карбоксильной группой субстрата.
Рис. 3.2.6. Изменение структуры карбоксипептидазы А при связывании с субстратом
На рис. 3.2.12 буквой А обозначен фермент без субстрата (Arg 145 показан желтым, Glu 270 – зеленым, Tyr 248-синим); буквой Б – фермент-субстратный комплекс (глицилтирозин, субстрат, изображен красным). На рисунке показана только часть молекулы фермента