
- •Учебное пособие
- •Раздел 1. Структура и свойства ферментов
- •Инженерная энзимология. Иммобилизованные ферменты. Новые пути практического использования ферментов. Применение ферментов в промышленности, сельском хозяйстве, медицине
- •Принцип классификации ферментов. Классы ферментов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Основные положения систематической и тривиальной номенклатуры ферментов
- •Способы количественного выражения активности ферментов. Единицы активности. Удельная и молекулярная активность
- •Методы определения активности ферментов: колориметрический, спектрофотометрический, флуориметрический, манометрический, биолюминесцентный и др.
- •Прямой и непрямой оптический тест Варбурга. Расчет ферментативной активности при определении по конечной точке и при кинетическом определении
- •Лекция 1.2 выделение и очистка ферментов
- •Разрушение клеток и экстракция белков
- •Тепловая денатурация
- •Осаждение белков
- •Гель-фильтрация
- •Разделение белков путем адсорбции
- •Выбор ионообменника
- •Элюция адсорбированного белка
- •Аффинная хроматография
- •Гидрофобная хроматография
- •Металлохелатная аффинная хроматография
- •Высокоэффективная жидкостная хроматография
- •Электрофорез
- •Изоэлектрическое фокусирование
- •Капиллярный электрофорез
- •Двумерные системы электрофореза
- •Кристаллизация белков
- •Лекция 1.3 уровни структурной организации ферментов
- •Многостадийный процесс образования пространственной структуры белка
- •Механизмы регуляции процесса сворачивания полипептидной цепи внутри клетки
- •Ферменты, участвующие в фолдинге белка
- •Специальные белки, увеличивающие эффективность сворачивания полипептидной цепи в нативную конформацию
- •Посттрансляционная модификация белка
- •Роль доменов в пространственной организации молекул ферментов
- •Увеличение числа доменов в ферменте и усложнение взаимодействий между ними
- •Роль доменов в формирование активного центра фермента
- •Роль доменов в регуляции ферментативной активности
- •Роль доменов в связывание ферментов с мембранами
- •Полифункциональные ферменты
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие реакции одного метаболического пути
- •Бифункциональные ферменты, катализирующие противоположно направленные реакции
- •Лекция 1.4 Кофакторы ферментов и их роль в катализе Коферменты, простетические группы, ионы металлов
- •Классификация кофакторов
- •Функции кофакторов
- •Кофакторы окислительно-восстановительных процессов Никотинамидные кофакторы
- •Кофакторы переноса групп Коферменты – производные пиридоксина
- •Кофакторы процессов синтеза, изомеризации и расщепления с-с связей Биотин
- •Роль металлов в функционировании ферментов
- •Лекция 1.5. Топография активных центров простых и сложных ферментов
- •Методы изучения активных центров ферментов
- •Раздел 2. Кинетика и термодинамика
- •Ферментативных реакций
- •Лекция 2.1.
- •Кинетика химических реакций
- •Скорость химической реакции
- •Основной постулат химической кинетики ‒ закон действия масс
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Реакции третьего порядка
- •Уравнения односторонних реакций 0-го, 1-го и 2-ого порядка
- •Реакции нулевого порядка
- •Реакции первого порядка
- •Реакции второго порядка
- •Молекулярность элементарных реакций
- •Методы определения порядка реакции
- •Зависимость скорости реакции от температуры. Уравнения Вант-Гоффа и Аррениуса.
- •Катализ
- •Лекция 2.2. Стационарная кинетика ферментативный реакций
- •Уравнение Михаэлиса-Ментен
- •Характеристика кинетических констант
- •Методы определения Км и Vmax
- •Лекция 2.3. Ингибиторы ферментов.
- •Конкурентное ингибирование
- •Неконкурентное ингибирование
- •Бесконкурентное ингибирование
- •Смешанный тип ингибирования
- •Субстратное ингибирование
- •Методы определения константы ингибирования. Метод Диксона
- •Лекция 2.4 Ферменты, не подчиняющиеся кинетике Михаэлиса-Ментен
- •Методы определения коэффициента Хилла
- •Раздел 3.Механизмы ферментативного катализа
- •Сущность явления катализа
- •Стадии образования фермент-субстратного комплекса
- •Природа сил, стабилизирующих различные конформационные состояния ферментсубстратного комплекса
- •Электростатические взаимодействия
- •Водородные связи
- •Вандерваальсовы взаимодействия
- •Гидрофобные взаимодействия
- •Факторы, определяющие эффективность и специфичность ферментативного катализа
- •Физико-химические механизмы ферментативного катализа
- •Лекция 3.2
- •Механизм действия гидролаз на примере карбоксипептидазы а
- •Связывание субстрата карбоксипептидазой а
- •Работы Липскомба с сотрудниками по установлению молекулярного механизма действия кпа
- •Методы для изучения механизма действия ферментов
- •Лекция 3.3 Специфичность – уникальное свойство ферментов
- •Относительная или групповая специфичность действия
- •Абсолютная специфичность действия
- •Стереоспецифичность ферментов
- •Концепция стерического соответствия «ключ-замок»
- •Концепция индуцированного соответствия
- •Раздел 4. Контроль активности ферментов лекция 4.1. Ферменты в клетке и организованных системах
- •Распределение ферментов в клетке
- •Ферменты, присутствующие в ядре
- •Ферменты митохондрий
- •Лизосомальные ферменты
- •Ферменты эндоплазматического ретикулума
- •Ферменты, локализованные в цитозоле
- •Мембранные ферменты
- •Уровни структурной организации ферментов в клетке
- •Мультиферментные комплексы
- •Пируватдегидрогеназный комплекс
- •Мультиферментные конъюгаты
- •Метаболоны
- •Лекция 4.2 Изостерические и аллостерические механизмы регуляции активности ферментов
- •Изостерическая регуляция
- •Vmax·[s]
- •Изоферменты
- •Лекция 4.3 ковалентная модификация ферментов и ее типы
- •Лекция 4.4
- •Регуляция количества ферментов в клетке
- •Контроль количества ферментов в клетке – процесс, зависящий от соотношения скоростей их биосинтеза и деградации.
- •Время полужизни различных ферментов
- •Фермент
- •Аминокислоты
- •Биосинтез ферментов и его регуляция на генетическом уровне. Конститутивные и индуцибельные (адаптивные) ферменты. Репрессия и индукция биосинтеза ферментов
- •Убиквитин-протеосомный путь деградации белков у эукариот. Убиквитин – белок, маркирующий белки для деградации. Строение 26s протеосомы
- •Раздел 5. Прикладное значение ферментов лекция 5.1. Генетическая инженерия ферментов
- •Использование рекомбинантных ферментов
- •Лекция 5.2 Ферменты в медицине (часть I)
- •Энзимодиагностика Органная специфичность в распределении ферментов
- •Ферменты сыворотки крови
- •Факторы, влияющие на уровень ферментов во внеклеточной жидкости
- •Диагностическое значение снижения ферментативной активности
- •Неспецифическое повышение ферментативной активности
- •Применение ферментов в качестве аналитических реагентов
- •Лактатдегидрогеназа
- •Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
- •Врождённые (наследственные) энзимопатии
- •Механизм возникновения наследственных энзимопатий
- •Блок обмена веществ
- •Примеры наследственных энзимопатий
- •Приобретённые энзимопатии
- •Энзимотерапия Использование ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Использование ингибиторов ферментов в качестве лекарственных препаратов
- •Библиографический список
Лекция 5.3 Ферменты в медицине (часть II) Энзимопатии
Энзимопатии (энзимопатологии) – общее название патологических состояний, развивающихся в результате отсутствия или снижения активности некоторых ферментов.
По основной классификации все энзимопатии делят на два типа:
1. Врождённые (наследственные) энзимопатии – заболевания, в основе которых лежит генетически обусловленное отсутствие, остаток или дефектная структура какого-либо фермента.
2. Приобретённые энзимопатии – заболевания, при которых энзимные нарушения наступают вторично, в ходе патологического процесса.
Кроме этого, в зависимости от клинического проявления, энзимопатии делят на три группы:
1. Энзимопатии с клиническими проявлениями;
2. Относительно бессимптомные энзимопатии;
3. Бессимптомные энзимопатии.
Врождённые (наследственные) энзимопатии
В настоящее время насчитывают около 1500 патологических состояний, начиная от нарушений до тяжёлых состояний с летальным исходом. Частота встречаемости составляет от 1:1000 до 1:1 млн новорожденных. С практической точки зрения наибольшее значение имеют заболевания с летальным исходом, которые встречаются чаще, чем бессимптомные энзимопатии.
До настоящего времени нет единой классификации наследственных энзимопатий, но все их делят в зависимости от типа нарушения обмена веществ:
1. Наследственные болезни обмена аминокислот;
2. Наследственные болезни обмена углеводов;
3. Наследственные болезни обмена липидов;
4. Наследственные болезни пуринового и пиримидинового обменов;
5. Наследственные болезни стероидного обмена;
6. Наследственные болезни обмена билирубина;
7. Наследственные болезни обмена металлов;
8. Наследственные болезни порфиринового обмена;
9. Наследственные болезни обмена соединительной ткани;
10. Наследственные болезни обмена крови и кроветворных тканей;
11. Наследственные болезни обмена, обусловленные нарушением (дефектом) канальцев почек;
12. Наследственные болезни обмена, обусловленные дефектом ферментов желудочно-кишечного тракта;
13. Наследственные болезни обмена, вызванные дефектом синтеза белков плазмы и иммуноглобулинов.
Механизм возникновения наследственных энзимопатий
С генетической точки зрения при всех врожденных энзимопатиях синтез энзимов с анормальной структурой и свойствами рассматривается как последствие мутаций. Доказаны мутации только структурных генов, но не исключено существование и мутаций гена-регулятора или гена-оператора. Мутации проявляются характерными изменениями в активности соответствующих энзимов. В одних случаях (у гомозигот по мутантному гену) энзимная активность отсутствует полностью или почти полностью. В других случаях (чаще у гетерозигот) активность энзима снижена незначительно, а в редких случаях даже может быть увеличена. Оценка этих изменений производится путем определения активности энзима в гомогенате некоторых органов (печени) или клетках (эритроциты, лейкоциты) и иногда из сыворотке.
Следует иметь в виду и комплекс факторов, могущих оказать влияние на определяемую активность. Ген-мутант может причинить описанные изменения энзимной активности по нескольким механизмам.
1. Путем синтеза энзима с измененной структурой и измененными каталитическими свойствами. Замена только одной аминокислоты в активном центре энзима может привести к снижению или отсутствию активности вопреки тому, что количество энзимного белка не изменено.
2. Путем синтеза энзима с измененной структурой, неизмененной каталитической активностью и сниженной стабильностью. Энзим денатурируется быстрее и сокращается время его полураспада, из-за чего снижается его активность.
3. Путем изменения скорости синтеза энзимного белка по причине мутации структурного гена или гена-регулятора. При сниженной скорости биосинтеза энзимная активность снижается, при увеличенной – повышается.
4. Путем влияния гена-мутанта на внутриклеточную концентрацию некоторых активаторов или ингибиторов.
Эти механизмы нередко комбинируются и это усиливает изменения в энзимной активности. Раскрытие точного механизма измененной энзимной активности при врожденных энзимопатиях часто связано с большими техническими трудностями из-за невозможности изолировать в достаточном количестве и охарактеризовать энзим при низкой активности его у данного индивидуума.